由自由生活小鼠传播的真菌共生体促进2型免疫

Fungal symbiont transmitted by free-living mice promotes type 2 immunity

作者信息Yun Liao, Iris H Gao, Takato Kusakabe, Woan-Yu Lin, Alexander Grier, Xiangyu Pan, Olga Morzhanaeva, Terrance P Shea, Hiroshi Yano, Danielle Karo-Atar, Kaitlin A Olsen, Ji Hoon Oh, Kurt J Vandegrift, Irah L King, Christina A Cuomo, David Artis, Barbara Rehermann, Neil Lipman, Iliyan D Iliev
PMID39604728
期刊Nature
发布时间2024-12
DOI10.1038/s41586-024-08213-2

实验完整度

研究包含体外真菌生物学实验、小鼠定植模型(SPF、GF、抗生素处理)、基因敲除小鼠(IL-33ΔIEC)、抗体阻断、转录组学、单细胞数据分析、寄生虫感染和过敏模型等多个独立证据层级,并具备功能验证和机制验证。

主要模型

C57BL/6小鼠 BALB/c小鼠 野生小鼠(NYC和LA) 野生型小鼠(wildling)

重点核对

K. pintolopesii菌株(W26G、IDNYC、ID1LA、QC1、C89-2)的来源和定植剂量(1×10^7 CFU) 饮食条件(纤维缺乏饮食FFD vs 常规饮食RC)对黏液厚度的影响 IL-33/ST2信号通路对2型免疫诱导的必要性(通过基因敲除和抗体阻断验证) 小鼠品系(C57BL/6 vs BALB/c)对过敏模型的影响 寄生虫感染的时间和剂量(N. brasiliensis 500 L3、Hpb 150 L3)

摘要

肠道真菌群对肠道稳态和免疫功能至关重要。然而,其变异性和实验室小鼠中真菌定植的不一致性阻碍了对共生关系的进化和免疫过程的研究。在此,通过对实验室、野生城市和农村小鼠的调查,我们发现Kazachstania pintolopesii是一种真菌共生体,具有出色的定植小鼠胃肠道(GI)并主导肠道真菌组的能力。其定植以不依赖细菌的方式进行,导致对其他真菌的定植抗性增强,并受到宿主免疫监视的屏蔽,从而允许共生体的存在。在黏膜环境变化后,K. pintolopesii定植触发小鼠的2型免疫应答并诱导胃肠道嗜酸性粒细胞增多。在机制上,我们确定K. pintolopesii通过诱导上皮IL-33和下游IL-33/ST2信号传导在黏液波动期间激活2型免疫。K. pintolopesii诱导的2型免疫以情境依赖的方式增强对蠕虫感染的抵抗力或加重胃肠道过敏。我们的发现表明,K. pintolopesii是一种小鼠共生体,并作为研究肠道真菌共生及其天然宿主免疫的宝贵模型生物。其在动物设施中的不被注意的存在突显了评估其对实验结果影响的必要性,并考虑K. pintolopesii对各种表型的影响。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
哪些真菌是真正的肠道共生体,以及它们如何与宿主免疫系统相互作用?
核心机制
K. pintolopesii通过诱导肠道上皮细胞产生IL-33,并激活下游IL-33/ST2信号通路,在黏液屏障受损时触发2型免疫应答。
主要证据
在SPF、GF及抗生素处理小鼠中,K. pintolopesii定植诱导嗜酸性粒细胞增多和Th2细胞极化;IL-33ΔIEC小鼠和ST2抗体阻断显著减弱这些反应;RNA-seq显示2型免疫相关基因上调。
研究意义
K. pintolopesii作为小鼠天然真菌共生体,可作为研究肠道真菌共生和免疫的模型,并需在实验动物设施中评估其存在对实验结果的影响。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

鉴定K. pintolopesii为小鼠肠道共生体

确定K. pintolopesii在实验室和野生小鼠中的存在及其定植特性。

对来自不同机构的实验室小鼠、野生城市和农村小鼠的粪便样本进行ITS测序和18S qPCR,并分离菌株进行系统发育分析。随后将菌株定植于小鼠,监测定植动态和传播。

2

研究K. pintolopesii的定植适应性

评估K. pintolopesii对胃肠道生态位的适应性,包括温度耐受、竞争和细菌独立性。

通过体外生长曲线、竞争实验、抗生素和GF小鼠模型,评估其温度偏好、对其他真菌的竞争排除作用以及不依赖细菌的定植能力。

3

检测K. pintolopesii对黏膜免疫的影响

确定在稳态和黏膜扰动下K. pintolopesii是否诱导免疫应答。

在常规饮食或纤维缺乏饮食下定植小鼠,通过流式细胞术分析免疫细胞(嗜酸性粒细胞、Th2细胞等)并检测IgA水平。在GF和抗生素处理小鼠中验证细菌独立性。

4

解析K. pintolopesii诱导2型免疫的机制

确定K. pintolopesii激活2型免疫的分子通路。

通过RNA-seq分析定植后胃组织的转录组,鉴定IL-33上调。使用IL-33ΔIEC小鼠和ST2抗体阻断验证IL-33/ST2通路。体外实验表明K. pintolopesii分泌的丝氨酸蛋白酶可切割IL-33。

5

评估K. pintolopesii在疾病模型中的作用

研究K. pintolopesii诱导的2型免疫对食物过敏和寄生虫感染的病理生理影响。

建立OVA诱导的食物过敏模型和两种线虫(N. brasiliensis和Hpb)感染模型,比较定植和未定植小鼠的疾病严重程度和寄生虫载量。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
沙保氏葡萄糖琼脂----
沙保氏葡萄糖肉汤----
RPMI 1640培养基----
胎牛血清Avantor Seradigm--
钙荧光白Sigma18909
SYBR GreenSigmaS7563
可固定活力染料eFluor 506Thermo Fisher Scientific65-0866-18
抗CD45抗体Biolegend103151,
抗GATA3抗体Thermo Fisher Scientific46-9966-42,
抗ST2抗体Biolegend145321
Trizol试剂----
Direct-zol RNA试剂盒Zymo Research--
iTaq SYBR greenBio-Rad1725122
QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR系统Thermo Fisher Scientific--
Illumina MiSeq测序仪Illumina--
Illumina HiSeq4000测序仪Illumina--
NovaSeq 6000测序仪Illumina--
RIPA裂解缓冲液Thermo Fisher Scientific89900
蛋白酶抑制剂混合物Sigma Aldrich5892988001
抗IL-33抗体R&DAF3625,
肌动蛋白抗体Cell Signaling Technology3700T
Clarity Western ECL底物Bio-Rad1705060
Amersham Imager 600成像系统GE Healthcare--
SpectraMax Plus 384酶标仪Molecular Devices--
GloMax Discover酶标仪PromegaGM3000
FITC标记的UEA-1抗体Vector LaboratoriesFL-1061-2
DAPI封片剂Thermo Fisher ScientificP36971
PAS染色试剂盒----
环磷酰胺Cayman13849
头孢哌酮Sigma--
硫酸链霉素GoldBioS-150-100
青霉素GGoldBioP-304-50
氟康唑SigmaPHR1160
卵清蛋白Sigma-AldrichA5503
Imject铝佐剂Thermo Scientific77161
抗ST2抗体Genentech--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
真菌菌株和培养
真菌菌株来源(W26G等)、培养条件(SDB,37°C)、灌胃剂量(1×10^7 CFU)
阅读提示:Methods: Fungal strains, Fungal colonization
小鼠模型和定植
小鼠品系(C57BL/6、BALB/c)、年龄(6-10周)、饮食(RC或FFD)、抗生素处理(如链霉素/青霉素)
阅读提示:Methods: Mice, Fungal colonization
免疫表型分析
组织采集(ssLN、十二指肠固有层等)、流式抗体克隆和稀释度、红细胞裂解步骤
阅读提示:Methods: Isolation of intestinal lamina propria, Antibodies and flow cytometry
机制验证
IL-33ΔIEC小鼠构建(Vil1Cre/20Syr)、抗ST2给药剂量(1mg/kg)和时间、RNA-seq数据处理参数
阅读提示:Methods: Mice, ST2 blockade, RNAseq
疾病模型
食物过敏模型(OVA剂量、佐剂、攻击次数)、寄生虫感染(N. brasiliensis L3数量、Hpb L3数量)
阅读提示:Methods: Gastrointestinal allergy model, Helminth infection