鉴定K. pintolopesii为小鼠肠道共生体
确定K. pintolopesii在实验室和野生小鼠中的存在及其定植特性。
对来自不同机构的实验室小鼠、野生城市和农村小鼠的粪便样本进行ITS测序和18S qPCR,并分离菌株进行系统发育分析。随后将菌株定植于小鼠,监测定植动态和传播。
Fungal symbiont transmitted by free-living mice promotes type 2 immunity
研究包含体外真菌生物学实验、小鼠定植模型(SPF、GF、抗生素处理)、基因敲除小鼠(IL-33ΔIEC)、抗体阻断、转录组学、单细胞数据分析、寄生虫感染和过敏模型等多个独立证据层级,并具备功能验证和机制验证。
C57BL/6小鼠 BALB/c小鼠 野生小鼠(NYC和LA) 野生型小鼠(wildling)
K. pintolopesii菌株(W26G、IDNYC、ID1LA、QC1、C89-2)的来源和定植剂量(1×10^7 CFU) 饮食条件(纤维缺乏饮食FFD vs 常规饮食RC)对黏液厚度的影响 IL-33/ST2信号通路对2型免疫诱导的必要性(通过基因敲除和抗体阻断验证) 小鼠品系(C57BL/6 vs BALB/c)对过敏模型的影响 寄生虫感染的时间和剂量(N. brasiliensis 500 L3、Hpb 150 L3)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定K. pintolopesii在实验室和野生小鼠中的存在及其定植特性。
对来自不同机构的实验室小鼠、野生城市和农村小鼠的粪便样本进行ITS测序和18S qPCR,并分离菌株进行系统发育分析。随后将菌株定植于小鼠,监测定植动态和传播。
评估K. pintolopesii对胃肠道生态位的适应性,包括温度耐受、竞争和细菌独立性。
通过体外生长曲线、竞争实验、抗生素和GF小鼠模型,评估其温度偏好、对其他真菌的竞争排除作用以及不依赖细菌的定植能力。
确定在稳态和黏膜扰动下K. pintolopesii是否诱导免疫应答。
在常规饮食或纤维缺乏饮食下定植小鼠,通过流式细胞术分析免疫细胞(嗜酸性粒细胞、Th2细胞等)并检测IgA水平。在GF和抗生素处理小鼠中验证细菌独立性。
确定K. pintolopesii激活2型免疫的分子通路。
通过RNA-seq分析定植后胃组织的转录组,鉴定IL-33上调。使用IL-33ΔIEC小鼠和ST2抗体阻断验证IL-33/ST2通路。体外实验表明K. pintolopesii分泌的丝氨酸蛋白酶可切割IL-33。
研究K. pintolopesii诱导的2型免疫对食物过敏和寄生虫感染的病理生理影响。
建立OVA诱导的食物过敏模型和两种线虫(N. brasiliensis和Hpb)感染模型,比较定植和未定植小鼠的疾病严重程度和寄生虫载量。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 真菌培养 | 沙保氏葡萄糖琼脂 | -- | -- |
| 沙保氏葡萄糖肉汤 | -- | -- | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Avantor Seradigm | -- | |
| 流式细胞术 | 钙荧光白 | Sigma | 18909 |
| SYBR Green | Sigma | S7563 | |
| 可固定活力染料eFluor 506 | Thermo Fisher Scientific | 65-0866-18 | |
| 抗CD45抗体 | Biolegend | 103151, | |
| 抗GATA3抗体 | Thermo Fisher Scientific | 46-9966-42, | |
| 抗ST2抗体 | Biolegend | 145321 | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | -- | -- |
| Direct-zol RNA试剂盒 | Zymo Research | -- | |
| qPCR | iTaq SYBR green | Bio-Rad | 1725122 |
| QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 测序 | Illumina MiSeq测序仪 | Illumina | -- |
| Illumina HiSeq4000测序仪 | Illumina | -- | |
| NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 蛋白分析 | RIPA裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 89900 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma Aldrich | 5892988001 | |
| 抗IL-33抗体 | R&D | AF3625, | |
| 肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3700T | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | 1705060 | |
| Amersham Imager 600成像系统 | GE Healthcare | -- | |
| SpectraMax Plus 384酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| GloMax Discover酶标仪 | Promega | GM3000 | |
| 组织学 | FITC标记的UEA-1抗体 | Vector Laboratories | FL-1061-2 |
| DAPI封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P36971 | |
| PAS染色试剂盒 | -- | -- | |
| 动物实验 | 环磷酰胺 | Cayman | 13849 |
| 头孢哌酮 | Sigma | -- | |
| 硫酸链霉素 | GoldBio | S-150-100 | |
| 青霉素G | GoldBio | P-304-50 | |
| 氟康唑 | Sigma | PHR1160 | |
| 卵清蛋白 | Sigma-Aldrich | A5503 | |
| Imject铝佐剂 | Thermo Scientific | 77161 | |
| 抗ST2抗体 | Genentech | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 真菌菌株和培养 | 真菌菌株来源(W26G等)、培养条件(SDB,37°C)、灌胃剂量(1×10^7 CFU) 阅读提示:Methods: Fungal strains, Fungal colonization |
| 小鼠模型和定植 | 小鼠品系(C57BL/6、BALB/c)、年龄(6-10周)、饮食(RC或FFD)、抗生素处理(如链霉素/青霉素) 阅读提示:Methods: Mice, Fungal colonization |
| 免疫表型分析 | 组织采集(ssLN、十二指肠固有层等)、流式抗体克隆和稀释度、红细胞裂解步骤 阅读提示:Methods: Isolation of intestinal lamina propria, Antibodies and flow cytometry |
| 机制验证 | IL-33ΔIEC小鼠构建(Vil1Cre/20Syr)、抗ST2给药剂量(1mg/kg)和时间、RNA-seq数据处理参数 阅读提示:Methods: Mice, ST2 blockade, RNAseq |
| 疾病模型 | 食物过敏模型(OVA剂量、佐剂、攻击次数)、寄生虫感染(N. brasiliensis L3数量、Hpb L3数量) 阅读提示:Methods: Gastrointestinal allergy model, Helminth infection |