验证糖酵解对细胞周期进入的必要性
确定糖酵解是否为细胞周期进入所必需。
使用CDK2生物传感器监测有丝分裂原刺激后MCF-10A细胞的周期进入，并通过2-DG抑制糖酵解或去除葡萄糖处理。
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mTOR通过瞬时灭活APC/C促进细胞周期进入期间的糖酵解
Transient APC/C inactivation by mTOR boosts glycolysis during cell cycle entry
实验完整度
高包含多层级验证：单细胞成像（APC/C活性生物传感器）、免疫共沉淀和体外激酶实验、重组APC/C泛素化实验、代谢检测（Seahorse、HYlight、代谢物示踪）及多种细胞类型（MCF-10A、RPE-1、MEF等）。
主要模型
MCF-10A细胞 RPE-1细胞 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） 人原代肺成纤维细胞
重点核对
APC/C瞬时失活发生在G0/G1过渡期，通过geminin-mCherry生物传感器实时检测 mTORC1介导的CDH1 Thr129磷酸化导致APC/C部分解离 PFKFB3的积累依赖于APC/C失活和mTOR信号 抑制瞬时APC/C失活（如CDH1 T129A突变或雷帕霉素处理）降低糖酵解率和细胞周期进入
摘要
哺乳动物细胞进入细胞周期时偏好糖酵解，以快速产生ATP并生成快速生物量积累所需的生物合成中间体。同时，泛素连接酶后期促进复合物/环体及其共激活因子CDH1（APC/CCDH1）保持活性，允许起始许可并阻断过早的DNA复制。矛盾的是，APC/CCDH1通过降解关键糖酵解酶来降低糖酵解，这引发了一个问题：细胞如何协调这些互斥事件以确保正确的细胞分裂。在这里，我们表明细胞通过在细胞周期进入期间瞬时灭活APC/C来解决这一悖论，这允许出现有利于糖酵解的瞬时代谢转变。在有丝分裂原刺激后，mTOR介导的APC/C衔接蛋白CDH1氨基末端的快速磷酸化使其部分从APC/C解离。APC/C的部分失活导致PFKFB3（一种糖酵解限速酶）的积累，促进向糖酵解的代谢转变。延迟的磷酸酶活性积累随后去除CDH1磷酸化，恢复完全的APC/C活性，并使细胞转向支持氧化磷酸化。因此，细胞通过一种不连贯的前馈回路协调细胞周期进程和代谢的同时需求，该回路瞬时抑制APC/C活性以产生哺乳动物细胞周期进入所需的一阵糖酵解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细胞如何在细胞周期进入阶段协调APC/C活性与糖酵解需求之间的相互排斥关系？
- 核心机制
- 有丝分裂原刺激后，mTORC1快速磷酸化CDH1的Thr129，导致CDH1从APC/C部分解离，引起APC/C的瞬时部分失活；随后蛋白磷酸酶延迟去除CDH1磷酸化，使APC/C恢复活性。这一不连贯前馈回路产生一阵糖酵解，支持细胞周期进入。
- 主要证据
- 在MCF-10A细胞中，通过APC/C生物传感器和CDK2生物传感器实时监测证实了APC/C的瞬时失活；通过免疫共沉淀、体外激酶实验和重组APC/C泛素化实验验证了mTOR对CDH1的磷酸化作用；通过ECAR、ATP产生速率和HYlight成像等实验显示糖酵解增加。
- 研究意义
- 该机制揭示mTOR-APC/C-蛋白磷酸酶回路调控细胞周期进入中的代谢重编程，可能为癌症等与细胞周期失调相关的疾病提供治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证APC/C抑制糖酵解
验证APC/C是否通过降解糖酵解酶抑制糖酵解。
在MCF-10A细胞中过表达CDH1，测量ECAR（糖酵解指标）。
检测APC/C活性在细胞周期进入中的动态变化
确定APC/C在G0/G1过渡期是否保持持续活性。
使用geminin-mCherry APC/C生物传感器，通过活细胞成像监测单个MCF-10A细胞在恢复生长后的APC/C活性。
鉴定mTORC1为调节APC/C活性的激酶
确定导致APC/C瞬时失活的信号通路。
使用多种激酶抑制剂和siRNA敲低实验，检测对APC/C瞬时失活的影响。
验证mTOR直接磷酸化CDH1并导致其解离
证实mTORC1磷酸化CDH1，引起CDH1从APC/C部分解离。
通过免疫共沉淀、体外激酶实验和磷酸化位点突变分析验证mTOR对CDH1的磷酸化和结合影响。
阐明APC/C再激活的机制：蛋白磷酸酶的作用
确定APC/C如何从瞬时失活中恢复活性。
使用广谱蛋白磷酸酶抑制剂处理细胞，观察APC/C活性变化，并通过数学模型模拟不连贯前馈回路。
验证瞬时APC/C失活导致PFKFB3积累和糖酵解增强
证明APC/C失活引起的PFKFB3积累足以驱动糖酵解增加。
测量在细胞周期进入期间PFKFB3蛋白水平、泛素化状态，并通过代谢检测（ECAR、ATP速率、HYlight成像、代谢物追踪）评估糖酵解变化。
评估瞬时APC/C失活对细胞周期进入的影响
确定瞬时APC/C失活是否对细胞周期进入至关重要。
通过过表达CDH1突变体或药物处理抑制瞬时APC/C失活，观察CDK2活化和细胞增殖。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| DMEM/F12培养基 | Invitrogen | -- | |
| 表皮生长因子 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 氢化可的松 | -- | -- | |
| 霍乱毒素 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| OPTI-MEM培养基 | Invitrogen | -- | |
| 潮霉素B | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| 链霉素 | Gibco | -- | |
| 青霉素 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D2650 |
| 雷帕霉素 | Tocris Biosciences | 1292/1 | |
| RMC6272 | Medchem Express | HY-134904 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| RO3306 | Calbiochem | SIG217714 | |
| 帕博西尼 | Selleckchem | S1116 | |
| PFK15 | Selleck Chem | S7289 | |
| 2-脱氧葡萄糖 | Sigma-Aldrich | D8375 | |
| 代谢分析 | d-葡萄糖（U-13C6, 99%） | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1396-2 |
| 细胞培养 | 透析马血清10 kDa | Bioivt | HSE00SRM-0108261 |
| 药物处理 | DRB18 | Cayman Chemical | 38217 |
| MG132 | Calbiochem | 133407-82-6 | |
| 原钒酸钠 | Sigma-Aldrich | 13721-39-6 | |
| 基因表达 | 多西环素 | -- | -- |
| 质粒构建 | H2B-mTurquoise | -- | -- |
| mCherry-Geminin（1-110） | -- | -- | |
| DHB（994-1087）-mVenus | -- | -- | |
| HA-CDH1 | -- | -- | |
| HA-CDH1（T129A） | -- | -- | |
| HA-CDH1（T129D） | -- | -- | |
| CMV-Hylight | Addgene | 193447 | |
| PFKFB3 | -- | -- | |
| PFKFB3-KEN突变体 | -- | -- | |
| 转染 | Dharmafect 1 | Horizon | -- |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | -- | |
| 活细胞成像 | 尼康Ti2-E倒置显微镜 | Nikon | -- |
| NIS elements（V5.11.00） | Nikon | -- | |
| 免疫印迹 | SDS-PAGE电泳缓冲液 | Bio-Rad | 1610772 |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| Bio-Rad半干转印系统 | Bio-Rad | 10026938 | |
| 免疫沉淀 | 蛋白G琼脂糖珠 | -- | -- |
| 磁珠Flag | Thermo Fisher Scientific | A36797 | |
| 体外激酶实验 | DDK-mTOR | Sigma-Aldrich | SRP0364 |
| DDK-DYRK4 | Carna Biosciences | 04-434 | |
| His-SUMO-CDH1 | Mybiosource | MBS1437931 | |
| GST-CDK1-cyclin B | Carna Biosciences | 04-102 | |
| GST-ERK | Reaction Biology | 0883-0000-1 | |
| 激酶缓冲液 | Cell Signaling Technology | 9802 | |
| ATP | Cell Signaling Technology | 9804 | |
| 体外泛素化实验 | 重组APC/C | -- | -- |
| UBE2C | -- | -- | |
| UBA1 | -- | -- | |
| 泛素 | -- | -- | |
| FAM-cyclin A2 | -- | -- | |
| FAM-cyclin B NTD | -- | -- | |
| Bis-Tris凝胶 | GenScript | M00654 | |
| Amersham Typhoon成像仪 | GE Healthcare | -- | |
| 细胞处理 | Zeba离心柱 | Thermo Fisher Scientific | PI89882 |
| Flag树脂悬液 | GenScript | L00432 | |
| 免疫印迹 | Clarity ECL | Bio-Rad | 1705060 |
| 代谢分析 | 糖酵解压力测试试剂盒 | Agilent technologies | 103020-100 |
| 糖酵解速率检测试剂盒 | Agilent technologies | 103344-100 | |
| ATP速率检测试剂盒 | Agilent technologies | 103591-100 | |
| Seahorse XF DMEM培养基 | Agilent Technologies | 103575-100 | |
| 寡霉素 | -- | -- | |
| 抗霉素/鱼藤酮 | -- | -- | |
| XF96孔板 | -- | -- | |
| Seahorse Wave 2.6.1软件 | Agilent | -- | |
| 结晶紫实验 | -- | -- | |
| ATP测量 | ATP检测试剂盒 | Abcam | ab113849 |
| qPCR | RNeasy 96 Qiacube HT试剂盒 | Qiagen | 74171 |
| Qiagen DNA消化试剂盒 | Qiagen | 79254 | |
| Bio-Rad cDNA制备试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| Bio-Rad SYBR green qPCR混合液 | Bio-Rad | -- | |
| 蛋白质纯化 | ESF921培养基 | Expression Systems | -- |
| Ni-NTA树脂 | Genesee Scientific | -- | |
| SP-琼脂糖树脂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白质消化 | Arg-C | Promega | -- |
| Pierce肽脱盐柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 质谱分析 | 纳升液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Orbitrap Eclipse质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 代谢组学 | TSQ Quantiva三重四极杆质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| NexeraXR液相色谱系统 | Shimadzu Scientific Instruments | -- | |
| Synergi Hydro-RP C18色谱柱 | Phenomenex | -- | |
| Xcalibur软件v.4.1 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 数据分析 | MATLAB | MathWorks | -- |
| Prism | GraphPad | -- | |
| 统计分析 | RStudio | RStudio | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与静止期诱导 | 细胞系（MCF-10A、RPE-1、MEF等）的来源和培养条件；饥饿时间（48或72小时）和饥饿培养基成分；对于MCF-10A，确认生长因子去除（无EGF和胰岛素）和基础培养基（DMEM/F12）以及补充剂（如BSA、霍乱毒素、青霉素-链霉素）。 阅读提示：Methods：Cell culture |
| 有丝分裂原刺激和细胞周期进入 | 刺激因子（EGF和胰岛素的浓度：20 ng/ml EGF和10 μg/ml胰岛素）；培养基更换时机；是否添加额外因子（如马血清）。 阅读提示：Methods：Cell culture, Treatment of cells |
| APC/C活性检测 | APC/C生物传感器（geminin-mCherry）的表达和成像条件；MG132使用浓度（10 μM）和处理时间；单细胞活性计算（斜率法）。 阅读提示：Methods：Time-lapse microscopy, Image analysis; Figure 1 and Extended Data Fig. 2 |
| mTOR抑制处理 | rapamycin的使用浓度（100 nM）和处理时机（通常在刺激时或刺激后1小时内）；RMC6272浓度（10 nM）。 阅读提示：Methods：Treatment of cells; Figure 2, 3 and Extended Data Fig. 3 |
| CDH1突变体表达 | CDH1(T129A)和CDH1(T129D)的表达方式（瞬转或诱导系统）；诱导所需多西环素的浓度（5 μM）和处理时间（8-12小时）。 阅读提示：Methods：Constructs and stable cell lines, Treatment of cells |
| PFKFB3检测 | PFKFB3抗体信息和免疫印迹条件；PFKFB3多聚泛素化检测（MG132预处理时间）；PFKFB3抑制剂PFK15浓度（2.5 μM）和处理时间。 阅读提示：Methods：Antibodies, Immunoprecipitation, Ubiquitination assay; Figure 4 |
| 糖酵解和代谢测量 | Seahorse实验的具体试剂盒和细胞接种密度；ECAR或ATP速率测量时的处理条件（如2-DG、寡霉素浓度）；HYlight成像条件和分析（GFP/Sapphire比值）。 阅读提示：Methods：Glycolysis and ATP rate measurements, ATP measurements; Figure 4 |
| 细胞周期进入评估 | CDK2生物传感器的表达和成像；CDK2活性阈值判定；集落形成实验持续时间和染色方法。 阅读提示：Methods：Time-lapse microscopy, Image analysis; Figure 5 |