天然eisosome的分离与结构解析
获得近天然eisosome的结构，观察膜脂质组织
从酵母中纯化天然eisosome，通过冷冻电镜螺旋重建解析九个不同直径的螺旋结构，并利用对称扩展和密度减除提高分辨率至3.2 Å。
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近天然拉伸敏感膜微域的冷冻电镜结构
Cryo-EM architecture of a near-native stretch-sensitive membrane microdomain
实验完整度
高包含冷冻电镜结构解析、体外重构、FRAP、CD光谱、分子动力学模拟、体内酵母突变体功能及形态验证，多层次证据。
主要模型
酵母eisosome螺旋管（天然来源） 重构的Pil1脂质管（含不同脂质组成） 酵母活细胞（pil1脂质结合突变株）
重点核对
天然eisosome纯化使用Bit61-TAP标签菌株，裂解缓冲液含0.5 mM CHAPS 冷冻电镜数据收集条件：Titan Krios 300 kV，K2或Falcon 4探测器，剂量40或50 e-/Ų 重构实验脂质组成：-PI(4,5)P2/+sterol（含30%胆固醇），+PI(4,5)P2/−sterol（含10% PI(4,5)P2），+PI(4,5)P2/+sterol（含10% PI(4,5)P2和15%胆固醇） FRAP实验使用200 nM Pil1-mCherry孵育30分钟 体内实验使用pil1脂质结合突变菌株（如pil1K130A/R133A）
摘要
生物膜被划分为称为膜微域的功能区，其中包含特定的脂质和蛋白质1–3。由于缺乏能够在原位可视化脂质而不干扰其天然行为的技术，膜微域的组成和组织仍然存在争议3,4。酵母eisosome由BAR结构域蛋白Pil1和Lsp1（以下称为Pil1/Lsp1）组成，它构成一个膜区室，通过压平并释放隔离因子来感知和响应机械应力5–9。在这里，我们分离了近天然的eisosomes，它们是由Pil1/Lsp1与质膜脂质结合的晶格构成的螺旋管，并通过螺旋重建解析了它们的结构。我们的结构揭示了膜脂质的显著组织，通过体外重构和分子动力学模拟，我们确认了Pil1/Lsp1外壳下方隔离的单个PI(4,5)P2、磷脂酰丝氨酸和固醇分子的定位。对天然来源eisosomes的三维变异性分析揭示了Pil1/Lsp1晶格的动态拉伸，这影响了这些脂质的隔离。总的来说，我们的结果支持一种机制，即Pil1/Lsp1晶格的拉伸释放了原本会被Pil1/Lsp1外壳锚定的脂质，从而为eisosome BAR结构域蛋白如何创建机械敏感膜微域提供了机制性见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Pil1/Lsp1支架蛋白如何组织膜脂质并响应机械应力？
- 核心机制
- Pil1/Lsp1晶格通过N端接触位点与两亲性螺旋（AH）连接，AH插入细胞质叶层并稳定PI(4,5)P2和固醇结合，形成微域。晶格拉伸导致脂质释放，从而响应机械应力。
- 主要证据
- 冷冻电镜结构显示AH插入细胞质叶层并伴随膜空泡模式；体外重构和MD模拟确认PI(4,5)P2、PS和固醇的结合位点；3DVA显示晶格拉伸与脂质密度丧失相关。
- 研究意义
- 提出了eisosome BAR结构域蛋白如何通过晶格拉伸释放隔离脂质，从而感知和响应机械应力，为理解膜微域的组织和功能提供了机制性见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
重构Pil1脂质管
鉴定天然结构中观察到的脂质密度对应的脂质种类
使用已知脂质组成的混合物重构Pil1管状结构，包括含/不含PI(4,5)P2和胆固醇的组合，并通过冷冻电镜解析结构，比较AH和脂质结合特性。
脂质结合验证
验证PI(4,5)P2、PS和固醇与Pil1的结合及其对AH插入的影响
使用圆二色光谱检测AH肽段在不同脂质条件下的折叠；使用FRAP测量脂质扩散和回收率；使用脂质分拣系数测量脂质积累；进行CG MD模拟计算脂质占据率。
体内功能验证
评估脂质结合突变对eisosome形态和细胞生理功能的影响
构建pil1脂质结合突变体，通过荧光显微镜观察eisosome形态和Nce102定位，通过生长实验检测对myriocin、nystatin等药物敏感性。
三维变异性分析（3DVA）
揭示天然eisosome晶格动力学及其对脂质组织的影响
使用cryoSPARC 3DVA分析对称扩展和密度减除的粒子，提取拉伸和压缩类，比较脂质结合和膜空泡模式。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白纯化 | IgG偶联Dynabeads M270 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| TEV蛋白酶 | -- | -- | |
| cOmplete蛋白酶抑制剂混合物（-EDTA） | Roche | -- | |
| 蛋白表达 | HisTrap Fast Flow柱 | Cytiva | GE17-5255-01 |
| HiTrap Q sepharose HP柱 | Cytiva | 17115401 | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL柱 | Cytiva | GE28-9909-44 | |
| HiPrep脱盐柱 | Cytiva | 17508701 | |
| Superdex 200 prep 16/600 | Cytiva | 28989335 | |
| 细胞裂解 | CHAPS | -- | -- |
| 二硫苏糖醇 | -- | -- | |
| 脂质重构 | 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 | -- | -- |
| 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸 | -- | -- | |
| 磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（脑） | -- | -- | |
| 胆固醇 | -- | -- | |
| 麦角固醇 | -- | -- | |
| 溴化麦角固醇 | -- | -- | |
| TopFluor-胆固醇 | -- | -- | |
| TopFluor-磷脂酰肌醇4,5-二磷酸 | -- | -- | |
| Atto647N DOPE | -- | -- | |
| 二氧化硅微球 | Corpuscular or Sigma-Aldrich | 140256-10 or 904384 | |
| 冷冻电镜样品制备 | lacey碳膜铜网 | Jena Bioscience | X-170-CU400 |
| 冷冻电镜 | Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Gatan K2 Quantum | Gatan | -- | |
| Falcon 4 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| CD光谱 | Jasco J-815圆二色谱仪 | Jasco | -- |
| 荧光显微镜 | Olympus IX83宽场显微镜 | Olympus | -- |
| ImageEM X2 EM-CCD相机 | Hamamatsu | -- | |
| 转盘共聚焦显微镜 | 3i (Intelligent Imaging Innovation) | -- | |
| Zeiss LSM 980（配备Airyscan 2） | Zeiss | -- | |
| 蛋白表达 | Q5高保真2X预混液 | New England Biolabs | M0492 |
| RecA重组酶 | New England Biolabs | M0249 | |
| NEBuilder HiFi DNA组装克隆试剂盒 | New England Biolabs | -- | |
| 药物处理 | 霉酚酸 | Sigma | M1177 |
| 制霉菌素 | Sigma | 475914 | |
| 阿托伐他汀 | Sigma | PHR1422 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 天然eisosome纯化 | 菌株：表达Bit61-TAP的酵母；裂解缓冲液：50 mM PIPES pH 7, 300 mM NaCl, 0.5 mM CHAPS, 0.5 mM DTT；洗涤缓冲液：50 mM PIPES pH 7, 300 mM NaCl, 1 mM CHAPS, 0.5 mM DTT；TEV浓度0.1 mg/ml，18°C 1小时 阅读提示：Methods：Purification of native-source eisosomes |
| 冷冻电镜数据收集 | 天然样品：Titan Krios 300 kV，K2探测器，总剂量40 e-/Ų，散焦-0.8至-1.8 μm，像素1.327 Å；重构样品：Falcon 4探测器，总剂量50 e-/Ų，散焦-0.6至-1.8 μm，像素0.83 Å 阅读提示：Methods：Cryo-EM grid preparation and data collection |
| 重构体系 | 脂质组成：-PI(4,5)P2/+sterol（30%胆固醇），+PI(4,5)P2/−sterol（10% PI(4,5)P2），+PI(4,5)P2/+sterol（10% PI(4,5)P2和15%胆固醇）；Pil1浓度15-20 μM，LUV浓度约2 mg/ml，30°C孵育1小时 阅读提示：Methods：Reconstitution of Pil1 tubules |
| FRAP测量 | Pil1-mCherry浓度200 nM，孵育30分钟；荧光恢复拍摄间隔500 ms，1-2分钟 阅读提示：Methods：Lipid diffusion measurements with FRAP |
| 体内实验 | 菌株背景：lsp1Δ；突变位点：pil1-K130A/R133A等；荧光成像使用Zeiss LSM 980；生长实验使用SC培养基 阅读提示：Methods：Yeast strains, Fluorescence microscopy, Spot assays |