样本采集与测序
获取覆盖美国主要流域的河流表层水微生物样本，并生成宏基因组和宏转录组数据。
通过WHONDRS和USGS NWQN众包方式采集166个样本，进行DNA/RNA共提取和测序（JGI和CU Anschutz），生成了约3.8 Tb数据。
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从北美河流众包构建的功能微生物组目录
A functional microbiome catalogue crowdsourced from North American rivers
实验完整度
高包含166个样本的宏基因组和宏转录组测序、3825个MAGs的组装与注释、代谢性状预测、功能基因表达分析以及地理空间与统计关联分析，并验证了核心微生物类群的功能与表达。
主要模型
美国河流表层水微生物群落 2,093个去冗余的宏基因组组装基因组（MAGs）
重点核对
总共166个样本，采样点地理分布覆盖美国90%的流域 宏基因组和宏转录组测序深度平均为其他研究的三倍 MAGs的组装采用三种不同流程（MEGAHIT、IDBA-UD、metaSPAdes）并用CheckM评估质量 微生物功能性状注释基于DRAM和自定义规则集 统计关联分析使用PERMANOVA、Mantel检验和Pearson相关分析
摘要
预测元素循环并在日益增长的人为影响下维持水质，需要了解河流微生物组空间驱动因素的知识。然而，由于缺乏基因组解析的功能洞察以及跨多条河流的采样，对控制河流生物地球化学的核心微生物过程的理解受到阻碍。在这里，我们利用社区科学努力加速河流微生物组的采样、测序和基因组解析分析，以创建基因组解析开放流域数据库（GROWdb）。GROWdb 描述了覆盖美国90%流域的河流表层水中微生物基因组的身份、分布、功能和表达。具体来说，GROWdb 涵盖了来自27个门的微生物谱系，包括来自10个科和128个属的新成员，并在基因组水平上定义了核心河流微生物组。结合广泛的地理空间信息进行的 GROWdb 分析揭示了微生物群落构建的局部和区域驱动因素，同时提出了关于生态系统功能的基础性假设。基于先前提出的河流连续体概念，我们叠加了微生物功能性状表达，这表明河流微生物组的结构和功能是可预测的。我们通过多种协作网络基础设施公开提供 GROWdb，以便跨学科广泛访问，用于流域预测建模和基于微生物组的管理实践。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 河流表层水微生物群落的基因组组成、功能潜力和表达模式如何随地理和环境梯度变化？
- 核心机制
- 河流表层水微生物群落的组成和功能沿河流大小（Stream Order）梯度呈现可预测的变化，其核心类群主要依赖有氧呼吸和光驱动能量代谢。
- 主要证据
- 基于163个宏基因组和57个宏转录组分析，发现核心活跃属（如Planktophilia, Methylopumilus等）普遍编码有氧呼吸和光驱动代谢基因；碳利用相关基因表达随河流大小变化；生物地理统计揭示Stream Order是最强驱动因素。
- 研究意义
- GROWdb提供了首个河流基因组资源，支持河流连续体概念在微生物群落功能层面的应用，为流域预测建模和水质管理提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
宏基因组组装和基因组分箱
从测序数据中重建高质量的微生物基因组（MAGs）。
对每个样本进行三种组装流程（MEGAHIT、IDBA-UD、metaSPAdes）和分箱（metaBAT2），用CheckM评估质量，最终去冗余得到2,093个MAGs。
功能注释和代谢性状预测
注释MAGs的潜在功能，并预测微生物的能量代谢和碳利用等性状。
使用DRAM对MAGs进行功能注释，并基于自定义规则集（如呼吸链复合物I、电子受体等）对基因组进行分类（如好氧、厌氧、发酵等），并预测碳固定途径。
宏转录组分析与基因表达定量
评估河流微生物群落的基因表达活性，并识别核心活跃类群。
将宏转录组读段映射到MAGs，用featureCounts定量基因表达，计算geTMM标准化表达值，筛选在至少10%样本中表达的基因和MAGs。
新兴污染物基因谱分析
评估河流微生物组降解新兴污染物（如抗生素、微塑料）的遗传潜力及表达。
通过CARD数据库和RGI工具预测抗生素抗性基因，并通过DRAM注释其他污染物降解基因，统计其在宏基因组和宏转录组中的分布。
地理空间和环境关联分析
识别影响河流微生物群落组成和功能表达的环境驱动因素。
收集每个采样点的地理空间和地球化学数据（287个变量），使用Mantel检验、PERMANOVA和Pearson相关分析评估环境因素与微生物群落的关系。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本采集和过滤 | Sterivex过滤器 | EMD Millipore | -- |
| DNA/RNA提取 | ZymoBIOMICS DNA/RNA提取试剂盒 | Zymo Research | R2002 |
| RNA纯化 | RNA清洁与浓缩-5试剂盒 | Zymo Research | R1013 |
| 文库构建 | Nextera XT试剂盒 | Illumina | -- |
| 测序 | Illumina NovaSeq测序仪 | Illumina | -- |
| rRNA去除 | Qiagen FastSelect探针组 | Qiagen | -- |
| cDNA文库构建 | TruSeq链特异性mRNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
| 文库定量 | KAPA Biosystems新一代测序文库qPCR试剂盒 | KAPA Biosystems | -- |
| Roche LightCycler 480荧光定量PCR仪 | Roche | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本采集和过滤 | 采用无菌技术，使用0.22μm Sterivex过滤器，并通过注射器收集约1升表层水；过滤后添加3ml RNAlater储存。需确认是否所有样本都遵循相同流程。 阅读提示：Methods: Sample collection through crowdsourcing and standardization of workflows |
| 核酸提取 | WHONDRS样本使用ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit和RNA Clean & Concentrator-5 kit进行DNA和RNA共提取；NWQN样本使用酚氯仿法提取DNA。提取后储存于-20°C。 阅读提示：Methods: Sample collection through crowdsourcing and standardization of workflows |
| 测序文库构建和测序 | 宏基因组文库使用Nextera XT试剂盒，片段化后大小选择450-600bp，在Illumina NovaSeq 2x150上进行测序；宏转录组文库使用TruSeq Stranded mRNA kit，并使用KAPA qPCR kit定量。 阅读提示：Methods: Metagenomic assembly, binning and annotation & Metatranscriptomic mapping and analysis |
| 宏基因组组装和分箱 | 采用三种组装流程（MEGAHIT、IDBA-UD、metaSPAdes）和binning（MetaBAT2），质量标准为完整性>50%，污染度<10%。去冗余基于99%平均核苷酸同一性。 阅读提示：Methods: Metagenomic assembly, binning and annotation |
| 功能注释和代谢性状分类 | MAGs使用DRAM注释，代谢性状基于自定义规则集（如呼吸链复合物I亚基>50%等）。 阅读提示：Methods: Microbial metabolism trait and carbon usage classification |
| 宏转录组定量 | 进行rRNA去除后构建cDNA文库，使用Bowtie2比对到MAGs，过滤掉低于97%同一性的reads，使用featureCounts定量，并进行geTMM标准化。 阅读提示：Methods: Metatranscriptomic mapping and analysis |
| 新兴污染物基因预测 | 使用RGI工具进行ARG预测，设置参数为'include loose'，但仅保留'perfect'或'strict'命中结果。其他污染物基因基于DRAM注释。 阅读提示：Methods: Microbial metabolism trait and carbon usage classification |
| 生物地理关联分析 | 需要每个采样点的配套地理空间数据（StreamCat等）和化学测量数据（如温度）。统计方法包括Mantel检验、PERMANOVA（999次置换）和Pearson相关分析。 阅读提示：Methods: Statistical analysis |