转录组图谱构建
利用SEnd-seq全面鉴定Mtb的转录起始位点、终止位点和反义RNA。
培养Mtb H37Rv、Msm mc2155和Eco，提取RNA并进行SEnd-seq文库制备和测序，鉴定TSS、TTS和asRNA。
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不完整转录本主导结核分枝杆菌转录组
Incomplete transcripts dominate the Mycobacterium tuberculosis transcriptome
实验完整度
高包含SEnd-seq转录组、NET-SEnd-seq、ChIP–seq、CRISPRi基因敲低、体外转录、翻译抑制剂处理等多层级验证，并有明确功能验证和机制验证。
主要模型
结核分枝杆菌H37Rv菌株 耻垢分枝杆菌mc2155菌株 大肠杆菌 体外转录反应体系
重点核对
SEnd-seq文库制备中5'端适配子连接效率 RNA聚合酶ChIP–seq抗体特异性 体外转录反应中RNA聚合酶与DNA模板比例 利奈唑胺处理浓度30 μg/ml及处理时间 rho敲低菌株中sgRNA诱导表达条件
摘要
结核分枝杆菌（Mtb）是导致结核病（TB）的细菌病原体，结核病是一种在全球范围内造成重大健康和经济成本的传染病。Mtb在其生命周期中会遇到多种环境，并主要通过重新编程其转录输出来应对这些变化。然而，Mtb转录的机制及其调控方式仍知之甚少。在这里，我们使用一种能够同时测定细菌细胞中单个RNA分子两端的方法，以高分辨率描绘Mtb转录组。出乎意料的是，我们发现大多数Mtb转录本是不完整的，其5'端位于转录起始位点，3'端位于下游200–500核苷酸处。我们表明，这些短RNA主要与暂停的RNA聚合酶（RNAPs）相关，而不是过早终止的产物。我们进一步表明，Mtb RNAP在转录早期高倾向性暂停依赖于σ因子的结合。最后，我们表明，正在翻译的核糖体促进转录延伸，揭示了转录-翻译偶联在控制Mtb基因表达中的潜在作用。总之，我们的发现描绘了一个以RNA聚合酶暂停产生的不完整转录本为显著特征的的分枝杆菌转录组。我们提出，暂停阶段构成Mtb中一个重要的转录检查点，允许细菌适应环境变化，并可被用于结核病治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 结核分枝杆菌转录组的全貌及其转录调控机制是什么？
- 核心机制
- Mtb RNA聚合酶在σA因子结合下倾向于在转录起始位点下游200–500核苷酸处暂停，产生大量不完整转录本；正在翻译的核糖体通过转录-翻译偶联促进转录延伸，使RNA聚合酶脱离暂停状态。
- 主要证据
- SEnd-seq显示大部分转录本不完整；NET-SEnd-seq和RNAP/σA ChIP–seq显示暂停RNA聚合酶占据在RNA覆盖度下降区域；体外转录实验证明σA因子促进暂停；利奈唑胺处理降低编码转录单元的进程因子（PF），而链霉素无此效应。
- 研究意义
- 揭示Mtb转录调控与大肠杆菌模型显著不同，暂停阶段可能是重要的转录检查点，允许细菌适应环境变化，并为靶向暂停RNA聚合酶的结核病治疗提供新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
不完整转录本鉴定
分析SEnd-seq数据中转录本长度分布，发现Mtb转录本在TSS下游200–500 nt处出现覆盖度下降。
对SEnd-seq数据计算每个转录单元的进程因子（PF），并比较Mtb、Msm和Eco的RNA覆盖度模式。
排除RNA降解因素
通过多种实验排除短转录本由RNA降解产生的可能性。
比较primary RNA和total RNA SEnd-seq数据；使用ATc诱导lacZ系统监测转录动态；通过CRISPRi敲低RNase基因并检测PF变化。
暂停RNA聚合酶验证
确定短转录本是否与暂停的RNA聚合酶结合。
开发NET-SEnd-seq方法富集RNAP结合的初生转录本；进行RNAP和σA因子的ChIP–seq实验。
Rho因子耗竭实验
验证短转录本是否由Rho介导的过早终止产生。
使用CRISPRi敲低rho基因，分析对PF和asRNA长度的影响。
体外转录实验
证明Mtb RNAP–σA的内在特性是产生短转录本的原因。
纯化Mtb RNAP–σA holoenzyme和core enzyme，在含AP3启动子的质粒DNA模板上进行体外转录，用qPCR分析产物长度。
翻译抑制影响验证
验证翻译对转录延伸的促进作用。
用利奈唑胺、克拉霉素、链霉素处理Mtb细胞，进行SEnd-seq分析PF变化；利用lacZ诱导系统检测翻译抑制对转录延伸的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | Difco Middlebrook 7H9肉汤 | BD | 271310 |
| 泰洛沙泊 | Sigma | T8761 | |
| 酪蛋白氨基酸 | BD | 223050 | |
| OADC添加剂 | BD | 212351 | |
| L-亮氨酸 | Sigma | L8000 | |
| 泛酸 | Sigma | P5155 | |
| 吐温-80 | VWR | M126 | |
| 7H11琼脂 | Sigma | M0428 | |
| CRISPR干扰 | pIRL58质粒 | Addgene | 166886 |
| pIRL19质粒 | Addgene | 163634 | |
| 卡那霉素 | Goldbio | K-120 | |
| 脱水四环素 | Sigma | 37919 | |
| RNA分离 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596 |
| 玻璃珠 | Sigma | G1145 | |
| Precellys Evolution匀浆器 | Bertin Technologies | 02520-300-RD000 | |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| SEnd-seq文库制备 | T4 RNA连接酶1 | New England BioLabs | M0437 |
| Agencourt RNAClean XP磁珠 | Beckman Coulter | A63987 | |
| RiboMinus转录组分离试剂盒 | Thermo Fisher | K155004 | |
| DNA聚合酶I | New England BioLabs | M0209S | |
| AMPure磁珠 | Beckman Coulter | A63882 | |
| dsDNA片段酶 | New England BioLabs | M0348S | |
| NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒 | New England BioLabs | E7645 | |
| Dynabeads M-280链霉亲和素磁珠 | Thermo Fisher | 11205D | |
| 3'-脱硫生物素-GTP | New England BioLabs | N0761 | |
| 牛痘病毒加帽系统 | New England BioLabs | M2080S | |
| 亲水链霉亲和素磁珠 | New England BioLabs | S1421 | |
| 测序 | Qubit 2.0荧光计 | Invitrogen | -- |
| Agilent 2200 Tape Station | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| NET-SEnd-seq | Ni-NTA磁珠 | Qiagen | 30230 |
| TURBO DNase | Life Technologies | AM2238 | |
| 裂解基质B管 | MP Biomedicals | 116911050 | |
| ChIP–seq | 抗大肠杆菌σ70因子抗体 | BioLegend | 663208 |
| 抗大肠杆菌RNA聚合酶β亚基抗体 | BioLegend | 663903 | |
| 蛋白A/G琼脂糖磁珠 | Thermo Fisher | 26159 | |
| 微球菌核酸酶 | New England BioLabs | M0247S | |
| 链霉蛋白酶 | Sigma | 537088 | |
| 免疫印迹 | 抗His标签抗体 | Santa Cruz | sc-8036 |
| qPCR | 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher | 4368814 |
| SYBR green主混合物 | Thermo Fisher | 4309155 | |
| QuantStudio5实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher | -- | |
| 抗生素处理 | 利奈唑胺 | Sigma | PZ0014 |
| 克拉霉素 | Sigma | C9742 | |
| 链霉素 | Sigma | S9137 | |
| 利福平 | Sigma | R3501 | |
| 体外转录 | RNase A | Thermo Fisher | EN0531 |
| 蛋白酶K | New England BioLabs | P8107S | |
| QIAQuick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 | |
| DNase I | New England BioLabs | M0303S |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细菌培养 | Mtb H37Rv菌株生长于含0.5%甘油、0.05% tyloxapol、0.2 g/l casamino acids和10% OADC的7H9肉汤，37°C培养 阅读提示：Methods: Bacterial strains and growth conditions |
| SEnd-seq文库制备 | 总RNA起始量5 μg，5'和3'适配子连接条件，rRNA去除步骤 阅读提示：Methods: Library preparation for total RNA SEnd-seq |
| CRISPRi | pIRL58质粒携带dCas9Sth1，sgRNA克隆及电穿孔条件，ATc诱导浓度100 ng/ml 阅读提示：Methods: CRISPR interference |
| NET-SEnd-seq | His-tagged RpoC表达菌株构建，ATc诱导12小时，Ni-NTA pull-down条件 阅读提示：Methods: NET-SEnd-seq |
| ChIP–seq | 甲醛交联时间30分钟，抗体用量（anti-σ70 3 μl，anti-RNAP 5 μl），微球菌核酸酶处理 阅读提示：Methods: ChIP–seq |
| 体外转录 | RNA聚合酶浓度2 pmol，DNA模板0.5 pmol，rNTP浓度100 μM，反应时间 阅读提示：Methods: In vitro transcription |
| 翻译抑制处理 | 抗生素处理浓度：利奈唑胺30 μg/ml，克拉霉素40 μg/ml，链霉素300 μg/ml，利福平50 μg/ml 阅读提示：Methods: RNA isolation |
| lacZ诱导系统 | ATc诱导浓度100 ng/ml，诱导时间点 阅读提示：Methods: Inducible lacZ transcription in Mtb |