鉴定FKBP11和CCDC134的共翻译相互作用
确定FKBP11和CCDC134是否在GRP94合成过程中与转位子结合及结合时机
通过亲和纯化结合mRNA测序（Rfoot-seq）分析FKBP11和CCDC134结合的核糖体，鉴定富集的转录本，并通过位置分析确定二者与新生链结合的时间。
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分泌性转运蛋白复合物上调控性N-糖基化的结构基础
Structural basis of regulated N-glycosylation at the secretory translocon
实验完整度
高包含冷冻电镜结构解析、选择性核糖体谱分析、细胞功能实验（突变体糖基化及受体表达检测）等多层级验证，结构-功能相互印证。
主要模型
GRP94新生链结合FKBP11/CCDC134的分泌型转位子复合物（冷冻电镜结构） HEK293细胞（野生型及基因敲除） RKO细胞（GRP94、STT3A或CCDC134敲除并回补）
重点核对
GRP94前N段（残基22-74）与OST-A活性位点的相互作用 CCDC134疏水沟槽与GRP94 αN1螺旋的结合 STT3A突变体（D363R、E623R）对GRP94与PSAP糖基化的差异影响 GRP94桥螺旋残基I66、L69脯氨酸突变导致高糖基化 FKBP11和CCDC134在GRP94合成过程中的核糖体结合动态
摘要
大多数人类分泌途径蛋白在进入内质网时被寡糖转移酶（OST）复合物进行N-糖基化。近期研究揭示了一种底物辅助机制，通过该机制，伴侣蛋白GRP94的N-糖基化受到调控，以控制细胞表面受体信号。本文报道了天然分离的GRP94折叠中间体与特化的CCDC134结合的转运蛋白复合物的结构。结合功能分析，数据揭示了GRP94中一个保守的N端延伸如何抑制OST-A，以及转运蛋白复合物内的结构重排如何保护系留的新生链免受不适当的OST-B糖基化。这些相互作用依赖于CCDC134的一个疏水沟槽，该沟槽识别新生GRP94的非天然构象。我们的结果定义了一种受调控的N-糖基化机制，并说明了新生链如何重塑转运蛋白复合物以促进其自身生物发生。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- GRP94新生链如何在分泌型转位子上通过重塑转位子复合物实现调控性N-糖基化？
- 核心机制
- GRP94前N段作为伪底物抑制剂占据OST-A活性位点，CCDC134通过疏水沟槽识别αN1螺旋并稳定新生链，形成的膜腔前庭屏蔽下游位点免受OST-B糖基化。
- 主要证据
- 冷冻电镜结构显示前N段与OST-A形成广泛接触，细胞实验证实前N段突变或CCDC134沟槽突变导致GRP94高糖基化及受体表达下降，STT3A远端突变特异影响GRP94而非PSAP。
- 研究意义
- 揭示了真核生物中新生链调控自身N-糖基化的一种机制，可能为先天性糖基化障碍的病理提供新解释，并提示FKBP11和CCDC134可能具有更广泛的转位子辅助功能。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
解析转位子复合物的冷冻电镜结构
获得GRP94新生链、FKBP11、CCDC134与转位子复合物的高分辨率结构
从FLAG-FKBP11 HEK293细胞制备核糖体，通过单颗粒冷冻电镜解析结构。
功能验证前N段和CCDC134在糖基化抑制中的作用
验证前N段和CCDC134对GRP94糖基化的调控作用
在GRP94敲除的RKO细胞中表达野生型或突变型GRP94/CCDC134/STT3A，检测GRP94糖基化状态及下游受体表达。
验证桥螺旋在连接OST-A和CCDC134中的作用
确定桥螺旋的刚性对GRP94糖基化抑制的重要性
通过引入脯氨酸突变破坏桥螺旋结构，检测对GRP94糖基化的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体 | CCDC134抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-393390 |
| GRP94抗体 | R&D Systems | MAB7606 | |
| GRP94抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-393402 | |
| LRP6抗体 | Cell Signaling Technology | 2560 | |
| α-微管蛋白抗体 | MilliporeSigma | T6199 | |
| α-微管蛋白抗体 | Abcam | ab11304 | |
| STT3A抗体 | Abnova | H00003703-M02 | |
| STT3A抗体 | Proteintech | 12034-1-AP | |
| IGF1Rβ抗体 | Cell Signaling Technology | 9750 | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| PSAP抗体 | GeneTex | GTX101064 | |
| HA抗体 | GenScript | A01244 | |
| HA抗体 | Bethyl | A191-102 | |
| uL22抗体 | Abcepta | AP9892b | |
| uL2抗体 | Abcam | ab169538 | |
| SEC61β抗体 | Cell Signaling Technology | 14648 | |
| TRAPα抗体 | MilliporeSigma | HPA011276 | |
| STT3B抗体 | Proteintech | 15323-1-AP | |
| FKBP11抗体 | Atlas Antibodies | HPA041709 | |
| FLAG抗体 | MilliporeSigma | F1804 | |
| BiP抗体 | BD Transduction Laboratories | 610978 | |
| 二级抗体 | 辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 |
| 辣根过氧化物酶标记的驴抗兔IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-144 | |
| 辣根过氧化物酶标记的驴抗兔IgG（Fc特异性） | Sigma-Aldrich | SAB3700863 | |
| 辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG H&L | Abcam | ab6728 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning | MT10013CV |
| 胎牛血清 | GeminiBio | 900-108 | |
| 青霉素-链霉素 | GeminiBio | 400-109 | |
| 通用支原体检测试剂盒 | ATCC | 30-1012K | |
| 细胞转染 | TransIT-293转染试剂 | Mirus Bio | MIR2700 |
| 聚乙烯亚胺 | Polysciences | -- | |
| 细胞培养筛选 | 嘌呤霉素 | InvivoGen | ant-pr-1 |
| 聚凝胺 | MilliporeSigma | -- | |
| 微体制备 | cOmplete无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11836170001 |
| 微球菌核酸酶 | NEB | M0247S | |
| RQ1无RNase的DNase | Promega | M610A | |
| SUPERaseIn RNA酶抑制剂 | Invitrogen | AM2696 | |
| 免疫沉淀 | anti-FLAG M2亲和凝胶 | MilliporeSigma | A2220 |
| 核糖体谱分析 | RNase 1 | LGC Biosearch Technologies | N6901K |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Ambion | 15596026 |
| RNA沉淀 | 乙酸钠 | Invitrogen | AM9740 |
| GlycoBlue共沉淀剂 | Invitrogen | AM9515 | |
| 异丙醇 | Fisher Scientific | BP2618 | |
| 冷冻电镜 | FLAG多肽 | APExBIO | A6001 |
| Quantifoil R1.2/1.3 400目金网 | -- | -- | |
| FEI Titan Krios冷冻电镜 | Thermo Fisher | -- | |
| K3 BioQuantum直接电子探测器 | Gatan | -- | |
| 功能分析 | SIGMAFAST蛋白酶抑制剂混合物 | MilliporeSigma | -- |
| PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| Novex Tris-甘氨酸4-12%凝胶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 内切糖苷酶H | New England Biolabs | P0702L | |
| Bio-Rad TGX预制胶 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| 转染 | Opti-MEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 克隆 | Gibson组装 | New England Biolabs | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养及细胞系构建 | HEK293和RKO细胞系的来源、基因敲除方法（CRISPR-Cas9）、稳定细胞系构建（doxycycline诱导）、培养条件（培养基、血清、抗生素浓度） 阅读提示：Methods: Cell culture, HEK293 cell lines, RKO cell lines |
| 选择性核糖体谱分析 | 微体制备、核糖体纯化、Rfoot-seq文库制备、数据处理参数及统计方法 阅读提示：Methods: Sample preparation for selective ribosome profiling, Selective ribosome profiling library preparation using Rfoot-seq, Rfoot-seq data processing and analyses |
| 冷冻电镜结构解析 | 样品制备（核糖体纯化、冷冻制样）、数据采集参数（电压、像素大小、曝光剂量）、图像处理流程（RELION 5.0、MotionCor2、CTFFIND4.1、Topaz） 阅读提示：Methods: Sample preparation for cryo-EM, Cryo-EM grid preparation and electron microscopy, Image processing |
| 功能验证 | 突变体设计、转染条件、细胞裂解、Western blot检测抗体及稀释度、EndoH处理 阅读提示：Methods: Functional analysis in RKO and HEK293 cell lines |