组织营养水平定量
量化小鼠血浆、CSF及六种组织间质液中124种代谢物的绝对水平，以评估不同组织微环境的营养可用性差异。
分离雌性NSG和B6小鼠的乳腺脂肪垫、肝、肺、肾、胰腺的间质液、血浆和CSF，采用液相色谱-质谱联用定量检测代谢物浓度。
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乳腺癌器官特异性转移的营养需求
Nutrient requirements of organ-specific metastasis in breast cancer
实验完整度
高包含代谢组学分析、构建多种营养缺陷型细胞系并进行体外功能验证、体内多器官转移模型（心内注射、颅内/乳腺脂肪垫植入）以及13C-葡萄糖示踪等独立证据层级，并进行了机制验证。
主要模型
MDA-MB-231细胞（人三阴性乳腺癌） HCC1806细胞（人三阴性乳腺癌） EO771细胞（小鼠乳腺癌）
重点核对
心内注射细胞数量：1×10^5 颅内注射细胞数量：MDA-MB-231和HCC1806为1×10^5，EO771为5×10^4 乳腺脂肪垫注射细胞数量：1×10^5 营养缺陷型细胞系：ASNS、ASS1、PHGDH、PYCR1/2/3、DHODH、GART基因敲除 动物品系：雌性NSG（MDA-MB-231、HCC1806）和C57BL/6J（EO771）小鼠
摘要
癌症转移是患者发病和死亡的主要原因，但决定癌症可以转移至哪些器官的因素尚未完全明了。在这里，我们量化了小鼠多种组织中124种代谢物的绝对水平，并研究了这如何与乳腺癌细胞在不同器官中生长的能力相关。我们通过基因工程改造了具有广泛转移潜力的乳腺癌细胞，使其对特定营养素产生营养缺陷型，并评估了它们在不同组织部位定植的能力。然后，我们探究了肿瘤在不同组织中的生长如何与营养物可用性和肿瘤生物合成活性相关。我们发现，单一营养素本身并不能定义乳腺癌细胞可以作为转移灶生长的部位。此外，我们确定嘌呤合成是肿瘤在许多组织中生长和转移所必需的，并发现这一表型与组织核苷酸可用性或肿瘤从头核苷酸合成活性无关。这些数据表明，微环境内多种营养素之间的复杂相互作用决定了转移性癌症生长的潜在部位，并强调了外在环境因素和内在细胞特性在影响乳腺癌细胞转移生长部位方面的相互依赖性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 组织中的营养可用性如何决定乳腺癌细胞转移生长的器官特异性？
- 核心机制
- 单一营养素水平不足以预测转移部位，转移偏好由微环境中多种营养素水平与细胞内在因素共同驱动；嘌呤合成（GART）在多种组织中均为肿瘤生长所必需，且不依赖于组织核苷酸可用性或从头合成活性。
- 主要证据
- 通过定量质谱分析124种代谢物在组织间质液中的水平，并结合心内注射、颅内/乳腺脂肪垫植入等体内模型，发现氨基酸营养缺陷型的组织特异性依赖因细胞系而异，而核苷酸合成缺陷（GART、DHODH）普遍抑制多部位转移和肿瘤生长。
- 研究意义
- 揭示了肿瘤代谢脆弱性的复杂性，提示需整合营养可用性、遗传、基质相互作用和适应途径来预测并利用不同肿瘤环境中的代谢弱点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建营养缺陷型细胞系
消除癌细胞适应营养缺乏的代谢补偿，以评估特定营养素合成能力对转移生长的作用。
利用CRISPR-Cas9在MDA-MB-231、HCC1806和EO771细胞中敲除ASNS、ASS1、PHGDH、PYCR1/2/3、DHODH、GART基因，并通过Western blot和增殖实验验证敲除及营养缺陷表型。
心内注射转移实验
评估营养缺陷型细胞在不同组织中的转移定植能力，以确定特定营养素合成对器官特异性转移的影响。
将表达荧光素酶的对照或缺陷型细胞经心内注射注入小鼠左心室，通过活体生物发光成像监测转移进展，终点时离体成像定量各器官转移负荷。
颅内和乳腺脂肪垫植入实验
绕过循环传播，直接评估营养缺陷型细胞在原位生长的代谢依赖，并比较不同植入途径对结果的影响。
将表达Gaussia荧光素酶的对照或缺陷型细胞经立体定向注入脑或注入乳腺脂肪垫，通过血液发光监测肿瘤生长，并记录生存期。
13C-葡萄糖代谢示踪
评估乳腺脂肪垫和脑肿瘤中从葡萄糖衍生的代谢物合成活性，以探究营养可用性与代谢依赖之间的关系。
对荷瘤小鼠进行[U-13C]-葡萄糖恒速输注，收集肿瘤和配对正常组织，通过LC-MS分析代谢物的同位素标记模式。
饮食干预实验
通过系统性降低丝氨酸和甘氨酸水平，评估营养缺乏对转移定植的影响。
给NSG小鼠喂食丝氨酸/甘氨酸缺乏饮食或对照饮食15天，然后心内注射HCC1806-Fluc细胞，评估各组织转移负荷。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Corning Life Sciences | 10-040-CV |
| 胎牛血清 | Gibco | 10437-028 | |
| 透析胎牛血清 | Gibco | 26400-044 | |
| 营养缺陷培养基制备 | 磷酸氢二钠 | Sigma-Aldrich | S5136 |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 不含氨基酸和磷酸钠的RPMI-1640培养基 | US Biological | R8999-04A | |
| 组织间质液分离 | 生理盐水 | Azer Scientific | 16005 |
| 滤纸 | VWR | 28298-020 | |
| 尼龙网过滤器 | Spectrum Labs | 148134 | |
| 血浆分离 | EDTA包被管 | Sarstedt | 41.1395.105 |
| 肿瘤模型建立 | Gluc和GFP慢病毒载体 | -- | -- |
| 腔肠素 | NanoLight Technology | 303 | |
| GloMax酶标仪 | Promega | -- | |
| 转移监测 | IVIS Spectrum成像系统 | PerkinElmer | -- |
| D-荧光素 | -- | -- | |
| Living Image软件 | PerkinElmer | -- | |
| 细胞系建立 | 胶原酶I | Worthington Biochemical | LS004194 |
| 分散酶II | Roche | 04942078001 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| 代谢组学分析 | 甲醇 | -- | -- |
| 甲酸 | -- | -- | |
| 13C-葡萄糖示踪 | [U-13C]-葡萄糖 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1396-1 |
| 氨基酸标准品（13C,15N） | Cambridge Isotope Laboratory | MSK-A2-1.2 | |
| 饮食干预 | 对照饮食 | Envigo | TD.110839 |
| 丝氨酸/甘氨酸缺乏饮食 | Envigo | -- | |
| 细胞增殖 | IncuCyte活细胞分析成像系统S3 | Sartorius | -- |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Cell Signaling Technology | 5871 |
| Western blot | LDS样品缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | NP0008 |
| ASNS一抗 | Proteintech | 14681-1-AP | |
| ASS1一抗 | Cell Signaling Technology | 70720 | |
| PHGDH一抗 | Sigma-Aldrich | HPA021241 | |
| PYCR1一抗 | Proteintech | 13108-1-AP | |
| PYCR2一抗 | Proteintech | 17146-1-AP | |
| PYCRL一抗 | Novus Biologicals | NBP2-03337 | |
| PYCRL一抗 | ABclonal | A17763 | |
| DHODH一抗 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166348 | |
| GART一抗 | Proteintech | 13659-1-AP | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 8457 | |
| Vinculin抗体 | Cell Signaling Technology | 13901 | |
| 过氧化氢 | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| 慢病毒包装 | pMD2.G质粒 | Addgene | 12259 |
| pMDLg/pRRE质粒 | Addgene | 12251 | |
| pRSV-Rev质粒 | Addgene | 12253 | |
| TransIT-293转染试剂 | Mirus | MIR 2700 | |
| CRISPR敲除 | lentiCas9/blast质粒 | Addgene | 52962 |
| lentiGuide-Puro质粒 | Addgene | 52963 | |
| 杀稻瘟菌素 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| Cas9-GFP和Cas9-RFP蛋白 | Integrated DNA Technologies | -- | |
| 4D核转染仪 | Lonza Bioscience | -- | |
| SF细胞系4D核转染试剂盒L | Lonza Walkersville | V4XC2024 | |
| LC-MS分析 | QExactive台式轨道阱质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Dionex UltiMate 3000高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SeQuant ZIC-pHILIC分析柱 | EMD Millipore | -- | |
| 碳酸铵 | -- | -- | |
| 氢氧化铵 | -- | -- | |
| 代谢组学数据处理 | XCalibur 2.2软件 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Compound Discoverer软件 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| IsoCorrector软件 | -- | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism软件 | GraphPad Software | -- |
| MetaboAnalyst软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 代谢物定量 | 小鼠品系（NSG和B6）和年龄（6-9周）、组织间质液样本合并方式（5只小鼠合并为一个样本）、样本收集后处理时间（冰上放置时间）、LC-MS参数 阅读提示：Methods: 'Isolation of interstitial fluid, CSF and plasma' 和 'Quantification of metabolite levels in biological fluids' |
| 营养缺陷型细胞系构建 | 基因敲除靶点（ASNS、ASS1等）、sgRNA序列、CRISPR-Cas9转染方法（慢病毒或RNP）、筛选药物浓度（blasticidin和puromycin） 阅读提示：Methods: 'CRISPR–Cas9-mediated gene knockout' 和补充表3 |
| 体外增殖验证 | 培养基类型（RPMI或DMEM）、缺乏的代谢物种类、补救代谢物浓度（如精氨酸1.15 mM、天冬酰胺379 µM等）、细胞培养时间 阅读提示：Methods: 'Cell proliferation' 和扩展数据图6 |
| 心内注射转移实验 | 细胞数量（1×10^5）、注射体积（100 µL）、小鼠品系（NSG或B6）、麻醉方式（异氟烷）、超声引导操作、终点时离体组织生物发光成像 阅读提示：Methods: 'Intracardiac injection and metastasis quantification' |
| 颅内和乳腺脂肪垫植入 | 细胞数量（颅内：MDA-MB-231和HCC1806为1×10^5，EO771为5×10^4；MFP：1×10^5）、注射体积（1 µL或30/50 µL）、立体定位坐标、肿瘤生长监测方法（Gaussia荧光素酶） 阅读提示：Methods: 'MFP and brain tumour model generation' 和扩展数据图11 |
| 13C-葡萄糖示踪 | [U-13C]-葡萄糖输注速率（0.4 mg/min）和时间（10小时）、禁食时间（4小时）、肿瘤生长时间（MFP 17天，脑14天）、组织和血浆提取方法 阅读提示：Methods: '13C-glucose tracing in brain and MFP tumours' 和图4 |
| 饮食干预实验 | 饮食类型（对照或缺乏丝氨酸/甘氨酸）、喂食持续时间（15天）、细胞注射时间（15天后）、饮食对血浆和组织代谢物的影响 阅读提示：Methods: 'Dietary serine or glycine restriction and metastasis assay' 和扩展数据图14 |