评估F11R/JAM-A对流动条件下血小板黏附的作用
验证F11R/JAM-A是否能够单独捕获流动血小板或增强血小板与纤维蛋白原的黏附。
使用VenaFlux平台，将纤维蛋白原或纤维蛋白原与Fc-F11R/JAM-A共包被于生物芯片，灌注全血（40 dynes/cm2），定量血小板覆盖面积和实时黏附事件。
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血小板F11R/JAM-A与表面结合的同源配体的同亲性相互作用促进血栓形成
Homophilic Interactions of Platelet F11R/JAM-A with its Surface-Bound Counterpart Facilitate Thrombus Formation
实验完整度
高包含体外流动腔实验、流式细胞术、阻抗聚集度测定、总血栓形成分析系统、Western blot、共聚焦显微镜及小鼠颈动脉损伤体内模型等多个独立证据层级，并进行功能验证。
主要模型
人全血血小板 小鼠颈动脉损伤模型 C57BL/6JRj小鼠
重点核对
F11R/JAM-A与纤维蛋白原共包被表面（100 µg/mL Fc-F11R/JAM-A） J10.4单克隆抗体及其Fab片段（50 µg/mL） 可溶性His标签F11R/JAM-A（浓度需见原文） T-TAS分析中血流剪切条件（40 dynes/cm2） 体内实验中FeCl3诱导的颈动脉损伤
摘要
背景：F11受体/连接黏附分子-A（F11R/JAM-A）是一种在血管内皮细胞、上皮细胞和血小板中表达的跨膜蛋白。在血小板中，F11R/JAM-A参与静态条件下的黏附，抑制血小板αIIbβ3整合素的激活，并据报道其可溶性形式通过同亲性相互作用激活血小板。目的：本研究旨在评估F11R/JAM-A是否参与流动条件下的血小板黏附和血栓形成。方法：使用流动腔实验评估F11R/JAM-A对流动条件下血小板黏附的贡献。使用单克隆抗体和重组F11R/JAM-A评估F11R/JAM-A阻断对血小板聚集和血栓形成的影响，采用总血栓形成分析系统。在小鼠颈动脉损伤模型中评估F11R/JAM-A阻断对体内血栓形成的影响。结果：F11R/JAM-A单独不能捕获流动的血小板，但在流动条件下增强了血小板与纤维蛋白原的黏附。用特异性单克隆抗体或重组F11R/JAM-A阻断F11R/JAM-A的同亲性相互作用，可损害人血液中体外血栓形成和小鼠血栓形成模型中的体内血栓形成。结论：流动血小板上的F11R/JAM-A与其表面结合的同源配体的相互作用增强了高剪切应力条件下血小板与纤维蛋白原的结合。阻断这些同亲性相互作用会损害血栓形成。虽然先前发表的研究指出了可溶性F11R/JAM-A在血栓形成过程中引发血小板的重要作用，但我们的结果强调了表面结合的F11R/JAM-A在此过程中的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- F11R/JAM-A的同亲性相互作用是否参与流动条件下的血小板黏附及血栓形成？
- 核心机制
- 流动血小板表面的F11R/JAM-A与表面结合或血栓中血小板表面的F11R/JAM-A发生反式同亲性相互作用，增强血小板与纤维蛋白原的结合，促进血栓形成。
- 主要证据
- 体外流动腔实验显示F11R/JAM-A与纤维蛋白原共包被增加血小板黏附；T-TAS显示J10.4抗体或其Fab片段及可溶性F11R/JAM-A显著延长闭塞性血栓形成时间；小鼠颈动脉损伤模型中BV11抗体降低血栓形成发生率。
- 研究意义
- 研究强调了表面结合的F11R/JAM-A在血栓形成中的作用，为理解血栓形成机制及潜在抗血栓策略提供了新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
制备并验证阻断F11R/JAM-A同亲性相互作用的工具
获得能够阻断F11R/JAM-A同亲性相互作用且无激活效应的抗体片段。
使用Pierce小鼠IgG1 Fab制备试剂盒酶切J10.4单克隆抗体，产生Fab片段，并通过SDS-PAGE确认；用聚集度测定验证Fab无激活效应。
评估F11R/JAM-A阻断对体外血栓形成的影响
验证阻断F11R/JAM-A同亲性相互作用是否抑制血栓形成。
使用T-TAS系统，将J10.4抗体、J10.4 Fab或可溶性His-tagged F11R/JAM-A加入全血，灌注胶原和血栓调节蛋白包被的毛细管，记录闭塞时间和压力曲线。
评估F11R/JAM-A阻断对血小板内信号的影响
验证阻断F11R/JAM-A是否影响血小板内Src激酶磷酸化。
血小板悬液铺于纤维蛋白原包被表面，存在J10.4 Fab或同型Fab，孵育后裂解，Western blot检测phospho-Src (Y416)、总Src和GAPDH。
评估F11R/JAM-A对血小板与纤维蛋白黏附形态的影响
验证F11R/JAM-A是否改变血小板黏附于纤维蛋白时的形态表型。
静态黏附实验，表面包被纤维蛋白或纤维蛋白+Fc-F11R/JAM-A，孵育富含血小板的血浆，固定后染色，使用Ilastik分类血小板形态（未活化、丝状伪足、片状伪足）。
评估F11R/JAM-A阻断对体内血栓形成的影响
验证F11R/JAM-A阻断在动物模型中是否抑制血栓形成。
小鼠颈动脉暴露，施以FeCl3损伤，静脉注射BV11抗体或同型IgG，利用激光多普勒血流仪监测血流，记录闭塞时间。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 流动腔实验 | VenaFlux平台 | Celix | -- |
| Vena8 Endo+生物芯片 | -- | -- | |
| AxioVert显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| 静态黏附实验 | Ibidi µ-Slide 15孔载玻片 | Ibidi | -- |
| 流式细胞术 | 抗CD41/PE抗体 | -- | -- |
| 抗JAM-A/FITC抗体 | BioLegend | -- | |
| J10.4/FITC抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| IG 1 κ/FITC同型对照 | BioLegend | -- | |
| FACS Canto II流式细胞仪 | BD Bioscience | -- | |
| 流动腔实验 | CellFix固定剂 | BD Bioscience | -- |
| Fc-JAM-A融合蛋白 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | 凝血酶受体激活肽 | -- | -- |
| 二磷酸腺苷 | -- | -- | |
| 聚集度测定 | Multiplate分析仪 | Hoffmann-La Roche | -- |
| Fab制备 | Pierce小鼠IgG1 Fab微量制备试剂盒 | ThermoFisher Scientific | -- |
| Western blot | Mini-PROTEAN TGX凝胶 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| 山羊抗Src抗体 | R&D Systems | -- | |
| 兔抗磷酸化Src (Y416)抗体 | R&D Systems | -- | |
| 兔抗GAPDH抗体 | Abcam | -- | |
| Pierce ECL蛋白印迹底物 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 动物实验 | ML191血流计 | ADInstruments | -- |
| ML870 PowerLab 8/30数据采集系统 | ADInstruments | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 流动腔血小板黏附实验 | Fc-F11R/JAM-A蛋白的浓度和来源；纤维蛋白原包被浓度；剪切力值（40 dynes/cm2）；全血抗凝方式（枸橼酸、凝血酶抑制剂）；重钙化条件（CaCl2浓度） 阅读提示：见Materials and Methods: Adhesion to Fibrinogen and F11R/JAM-A under Flow Conditions |
| T-TAS血栓形成分析 | J10.4抗体、Fab片段和可溶性F11R/JAM-A的浓度和孵育时间；T-TAS系统型号及毛细管涂层（胶原或胶原+血栓调节蛋白）；全血抗凝方式（肝素或枸橼酸） 阅读提示：见Materials and Methods: Thrombus Formation Analysis |
| 动物模型（FeCl3诱导损伤） | BV11抗体剂量和给药途径；FeCl3浓度和体积；血流监测设备设置；小鼠品系、周龄和体重 阅读提示：见Materials and Methods: Ferric Chloride-Induced Injury |