建立标记系统
实现对TRiC、PFD、核糖体和客户蛋白的单分子可视化。
通过CRISPR-Cas9敲入HaloTag标记CCT4和PFD4，通过稳定表达SNAP-L10A标记核糖体，并通过MS2-MCP和SunTag体系标记肌动蛋白mRNA和新生链。
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体内TRiC伴侣蛋白系统的单分子动力学
Single-molecule dynamics of the TRiC chaperonin system in vivo
实验完整度
高结合CRISPR敲入标记、活细胞单颗粒追踪、选择性核糖体图谱及生化实验，涵盖共翻译和翻译后验证，并包含功能缺陷突变体分析。
主要模型
人U-2 OS细胞系 β-肌动蛋白新生链（全长及截短体） β-肌动蛋白G150P突变体
重点核对
TRiC和PFD的稀疏标记比例：约3% TRiC、约9% PFD（JF646和TF-TMR标记） 核糖体标记：SNAP-L10A融合蛋白，TF-TMR标记 mRNA标记：MS2-MCP-GFP系统，24xMS2茎环插入β-肌动蛋白mRNA的3'UTR PFD3敲低细胞系：通过CRISPR-Cas9介导的基因缺失 单颗粒追踪分析：共定位阈值0.5 µm，持续时间>500 ms定义为相互作用
摘要
必需的伴侣蛋白T复合物蛋白环复合物(TRiC)(也称为含有TCP-1的伴侣蛋白(CCT))与辅助伴侣蛋白前折叠蛋白(PFD)协同介导蛋白质折叠1–5。体外实验表明，圆柱形TRiC复合物通过ATP调节的客户蛋白封装促进折叠6–9。然而，伴侣蛋白系统在体内的功能动力学仍未探索。在这里，我们开发了人细胞中的单颗粒追踪技术，以监测TRiC–PFD与新合成蛋白质的相互作用。这两种伴侣蛋白反复以短暂的探测事件(通常持续约1秒)与新生多肽结合，其中PFD招募TRiC。如伴侣蛋白客户肌动蛋白8所示，PFD和TRiC的共翻译相互作用在链延伸过程中频率和寿命增加。在翻译终止附近，PFD结合数秒，促进TRiC招募以进行涉及约2.5秒多个反应循环的翻译后折叠。值得注意的是，TRiC与折叠缺陷型肌动蛋白突变体的相互作用寿命显著延长，表明客户蛋白的构象特性调节TRiC功能。突变肌动蛋白持续在TRiC上循环，直到被靶向降解。TRiC在连续结合循环之间通常保持在其客户蛋白附近受限，这表明伴侣蛋白机制在一个局部‘保护区内’运作，其中自由扩散受到限制。总之，这些发现为细胞环境中伴侣蛋白系统的单分子动力学和超分子组织提供了详细见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在活细胞环境中，TRiC和PFD伴侣蛋白系统如何与新生多肽及翻译后客户蛋白相互作用？其动态机制和超分子组织是什么？
- 核心机制
- PFD招募TRiC，并通过延长TRiC与底物的结合时间促进其与新生链或翻译后客户蛋白的相互作用；TRiC在局部'保护区'内对客户蛋白进行重复绑定，直至折叠完成或靶向降解。
- 主要证据
- 利用单颗粒追踪观察到TRiC和PFD与核糖体及肌动蛋白新生链的短暂相互作用（约1秒）；PFD敲低减少TRiC结合频率和寿命。利用核糖体束缚的肌动蛋白-SunTag观察翻译后相互作用，发现TRiC结合呈双组分（约0.9秒和2.4秒）。折叠缺陷型肌动蛋白G150P在TRiC上的停留时间延长3-4倍。
- 研究意义
- 揭示了伴侣蛋白系统在体内的动态行为，提出局部'保护性折叠区'模型，加深了对细胞内蛋白质折叠保真度机制的理解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
共翻译相互作用分析
观察TRiC和PFD与新生链的相互作用，并验证PFD对TRiC招募的作用。
双色单分子成像，记录TRiC/PFD与核糖体或肌动蛋白mRNA的共定位动态；敲低PFD3观察对TRiC结合的影响。
链长依赖性研究
探究新生链长度对TRiC和PFD结合频率和持续时间的影响。
表达不同长度的肌动蛋白截短体（1-101, 1-168, 1-305, 1-368），并观察与PFD和TRiC的相互作用。
翻译后折叠分析
观察翻译后TRiC和PFD与完整肌动蛋白的相互作用。
使用SunTag和Xbp1u+序列将肌动蛋白束缚在核糖体上，以减慢扩散，并观察与TRiC和PFD的相互作用。
突变体分析
探究客户蛋白构象对TRiC和PFD相互作用的影响。
利用G150P肌动蛋白突变体，观察其与TRiC和PFD的相互作用，并检测其降解情况。
连续循环观察
观察TRiC在客户蛋白附近的连续结合循环，提出局部'保护区'模型。
分析TRiC与客户蛋白的'开-关-开'事件，检测其在关闭状态下的扩散行为。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | U-2 OS细胞 | ATCC | HTB-96 |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher | -- |
| Neon转染系统 | Invitrogen | -- | |
| 单分子标记 | Janelia Fluor (JF) HaloTag配体 | Promega | -- |
| SNAP-tag配体TF-TMR | K. Johnsson提供 | -- | |
| DNA构建 | Q5定点突变试剂盒 | NEB | -- |
| 蛋白质印迹 | 2× SDS样品缓冲液 | Sigma-Aldrich | -- |
| NuPAGE 4–12% Bis-Tris蛋白质凝胶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| NuPAGE MOPS SDS电泳缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PVDF膜 | Roche | -- | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab8226 | |
| 抗CCT4抗体 | Merck | HPA029349 | |
| 抗DYKDDDDK标签抗体 | Cell Signal | 2368S | |
| 抗GAPDH抗体 | Merck | MAB374 | |
| 抗HaloTag抗体 | Promega | G9211 | |
| 抗前折叠蛋白3抗体 | Santa Cruz | sc-390524 | |
| 抗前折叠蛋白4抗体 | Thermo Fisher | 16045-1-AP | |
| 抗RPL10A抗体 | Abcam | ab174318 | |
| 抗RPL29抗体 | Thermo Fisher | PA5-27545 | |
| 抗GCN4 (SunTag)抗体 | Addgene | 218104-rAb | |
| 抗SNAP-tag抗体 | NEB | P9310S | |
| 抗小鼠IgG-HRP二抗 | Merck | A4416 | |
| 抗兔IgG-HRP二抗 | Merck | A9169 | |
| Amersham Image Quant 800 | Cytiva | -- | |
| 免疫沉淀 | Halo-Trap磁性琼脂糖珠 | Chromotek | -- |
| 蛋白降解 | MG-132 | -- | -- |
| 嘌呤霉素 | Gibco | -- | |
| 质谱 | 胰蛋白酶 | Promega | -- |
| Lys-C内切酶 | Wako | -- | |
| QExactive HF质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 单分子成像 | Zeiss Elyra PS.1显微镜 | Zeiss | -- |
| µ-Dish 35 mm高玻璃底培养皿 | Ibidi | -- | |
| Hanks平衡盐溶液 | Gibco | 14025092 | |
| 细胞裂解 | cOmplete蛋白酶抑制剂 | Roche | -- |
| Benzonase核酸酶 | -- | -- | |
| 腺苷三磷酸双磷酸酶 | -- | -- | |
| 二硫苏糖醇 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：U-2 OS；培养基：DMEM含10% FBS；培养条件：37°C，5% CO2；传代方法 阅读提示：Methods: Cell lines |
| 标记系统构建 | CCT4-Halo敲入位点（S202-V203）；PFD4-Halo敲入位点（C末端）；SNAP-L10A表达载体；筛选方法（嘌呤霉素、FACS） 阅读提示：Methods: Cell lines and Extended Data Fig. 1 |
| 单分子标记 | JF646浓度（TRiC-Halo: 50 pM；PFD-Halo: 800 pM）；SNAP配体TF-TMR浓度；标记时间（20-30分钟）；洗涤步骤 阅读提示：Methods: Sparse labelling |
| 单分子成像 | 显微镜设置：Zeiss Elyra PS.1，TIRF模式，500帧，50ms曝光；细胞孵育条件：37°C，5% CO2 阅读提示：Methods: Fluorescence microscopy |
| 数据分析 | 单颗粒追踪参数：TrackMate检测器、关联参数（链接最大距离0.5 µm，间隙关闭最大距离0.5 µm，最大帧0）；共定位阈值：距离<500 nm，持续时间>500 ms 阅读提示：Methods: SPT and colocalization analysis |
| PFD3敲低 | sgRNA序列：TAAAGTGTGTCTGTGGTTGG；细胞系构建：CRISPR-Cas9，嘌呤霉素筛选；PFD3蛋白水平降低>90% 阅读提示：Methods: Cell lines and Extended Data Fig. 2 |
| 共翻译相互作用测定 | MS2-MCP-GFP标记mRNA；截短体长度（101, 168, 305, 368）；嘌呤霉素处理浓度和时间 阅读提示：Methods: Plasmids and Fig. 1 |
| 翻译后相互作用测定 | SunTag-Xbp1u+系统；嘌呤霉素追迹时间点；MG-132处理（浓度10 µM，处理时间4小时） 阅读提示：Methods: Kinetics of actin transit to TRiC reflecting TRiC-mediated folding |
| 蛋白质降解检测 | CHX追迹浓度（150 µg/ml）和时间（0.5, 0.75, 1, 2小时）；RIPA缓冲液使用 阅读提示：Methods: Cycloheximide chase |