凝血酶原活性位点S4亚口袋修饰赋予达比加群抗性

直接抗凝剂通过高亲和力可逆地结合丝氨酸蛋白酶活性位点来抑制凝血过程。通过修饰凝血因子Xa的活性位点S4亚口袋，我们引入了抑制剂抗性，同时保留了催化活性。考虑到FXa和凝血酶在活性位点结构和直接抗凝剂结合方面的同源性，我们靶向S4亚位点，在（前）凝血酶中引入抑制剂抗性。生成了重组凝血酶原变体，其中I174被替换，或R92-N98序列被替换为人激肽释放酶-3的序列。与野生型相比，变体的特异性凝血酶原凝血活性降低了6倍（内源性凝血）至10倍（外源性凝血）。进一步分析表明，S4亚位点的修饰阻碍了凝血酶对纤维蛋白原和血栓调节蛋白介导的蛋白C的转化。与此一致，凝血酶变体对用于凝血酶生成评估的肽基底物的催化效率降低。与野生型凝血酶原相比，变体对达比加群的敏感性降低了2倍，而阿加曲班的抑制作用不受影响。使用纯化组分系统的分析显示，达比加群和阿加曲班抑制凝血酶的IC50分别降低了高达24倍和4倍。对达比加群结合和未结合（apo）的修饰凝血酶变体进行的分子动力学模拟表明，与野生型凝血酶相比，这些变体包含更大的抑制剂结合口袋，并显示出降低的抑制剂结合能力。总体而言，具有S4亚位点修饰的（前）凝血酶变体在治疗浓度的达比加群存在下仍支持可检测的纤维蛋白形成。我们的研究结果为通过调节S4亚位点来设计对直接凝血酶抑制剂具有抗性的凝血酶变体提供了概念验证。