PDI保守性分析
确定PDI在哺乳动物中的保守性
使用Ensembl获取17个物种的PDI直系同源序列，进行多序列比对并计算百分比同一性矩阵。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
胚胎来源的蛋白质PDI在胎盘哺乳动物中高度保守，并在体外以物种特异性方式改变具有不同着床策略物种的子宫内膜转录组和分泌组
The embryo-derived protein PDI is highly conserved among placental mammals and alters the endometrial transcriptome and secretome in vitro across species with differing implantation strategies†
实验完整度
高84
主要模型
原代牛子宫内膜上皮细胞（bEECs） 原代牛子宫内膜基质细胞（bESCs） 人子宫内膜上皮Ishikawa细胞系 BeWo人滋养层球状体附着模型
重点核对
细胞类型：原代牛子宫内膜上皮细胞（bEECs）和基质细胞（bESCs），人Ishikawa细胞系 处理：重组牛PDI（rbPDI）浓度10、100、1000 ng/ml，处理24小时 对照：培养基对照和PBS对照 RNA-seq样本：bEEC和bESC（n=3）处理组为1000 ng/ml rbPDI、100 ng/ml roIFNT+1000 ng/ml rbPDI；Ishikawa（n=3）处理组为1000 ng/ml rbPDI 附着实验：Ishikawa细胞（n=5）与BeWo球状体共培养，siRNA敲低MNS1
摘要
哺乳动物的妊娠建立需要一系列复杂的事件，包括双向的胚胎-母体通讯，直至着床。这是大多数哺乳动物（包括人类和食品生产物种）妊娠丢失发生的时期，胚胎-母体通讯失调会导致妊娠丢失。胚胎来源因子会改变子宫内膜的功能以促进妊娠成功。我们假设这些先前未探索的胚胎来源蛋白质可能参与改变子宫内膜功能，以促进具有不同早期妊娠表型的哺乳动物的早期妊娠事件。在这里，我们表明蛋白质二硫键异构酶（PDI）在哺乳动物中是一种高度保守的蛋白质，并提供了PDI在具有不同着床策略的哺乳动物子宫内膜功能中发挥物种特异性作用的证据。我们展示了PDI如何在人类和牛的体外以物种特异性方式改变子宫内膜转录组，并使用微流控方法证明了它改变了子宫内膜的分泌组能力。我们还提供了使用人源细胞进行的体外实验证据，表明MNS1（一种在人源和牛源子宫内膜上皮细胞中响应PDI而通常下调的转录本）可能参与着床的附着阶段。我们提出滋养层来源的蛋白质PDI参与支持子宫内膜分泌的子宫腔液（ULF）的调节，以支持胚胎的营养，并参与胚胎附着到子宫腔以在哺乳动物中成功妊娠的过程。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探讨概念来源蛋白PDI是否在具有不同着床策略的哺乳动物（人类和牛）中保守，并通过改变子宫内膜的转录组和分泌组来促进早期妊娠事件。
- 核心机制
- PDI以物种特异性和细胞特异性方式改变子宫内膜上皮细胞和基质细胞的转录组，并改变子宫内膜的分泌组；在人类和牛的子宫内膜上皮细胞中，PDI下调MNS1表达，而MNS1的敲低降低了滋养层球状体的附着能力，表明PDI可能通过MNS1参与着床的附着阶段。
- 主要证据
- qRT-PCR和RNA-seq显示rbPDI在牛子宫内膜细胞中诱导大量差异表达基因，在人Ishikawa细胞中诱导较少；微流控结合质谱显示rbPDI改变牛和人的分泌组；siRNA敲低MNS1显著降低BeWo球状体的附着率。
- 研究意义
- 发现PDI在具有不同着床策略的哺乳动物中发挥物种特异性的子宫内膜功能，可能支持母体免疫调节和胚胎附着，为理解着床机制提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
重组蛋白制备
获得用于处理细胞的重组牛PDI（rbPDI）和重组绵羊IFNT（roIFNT）
利用大肠杆菌表达系统生产rbPDI，纯化后溶于PBS；roIFNT由合作者提供。
原代牛子宫内膜细胞培养和处理
检测rbPDI对牛子宫内膜细胞基因表达的影响
分离原代bEECs和bESCs，培养至70%融合后，用不同浓度rbPDI（10、100、1000 ng/ml）处理24小时，并设置对照。
人子宫内膜细胞培养和处理
检测rbPDI对人子宫内膜上皮细胞基因表达的影响
培养Ishikawa细胞，处理同上，检测基因表达。
RNA提取和qRT-PCR
验证rbPDI处理后的基因表达变化
提取RNA，反转录为cDNA，使用qRT-PCR检测目标基因表达。
RNA测序和数据分析
全转录组分析rbPDI处理后的差异表达基因
对选定的样本进行RNA-seq，利用DESeq2分析差异表达基因，并进行GO和KEGG富集分析。
附着实验（siRNA敲低MNS1）
检测MNS1敲低对滋养层球状体附着的影响
用siRNA敲低Ishikawa细胞中的MNS1表达，然后加入BeWo球状体共培养，统计附着率。
微流控分泌组分析
检测rbPDI对子宫内膜上皮细胞分泌组的影响
在微流控芯片中培养细胞，持续流动rbPDI处理24小时，收集条件培养基进行质谱分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| DMEM/F12培养基 | Gibco | -- | |
| 活性炭剥离胎牛血清 | PAA Cell Culture Company | -- | |
| 胎牛血清 | PAA Cell Culture Company | -- | |
| 抗生素抗真菌溶液 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 谷氨酰胺链霉素青霉素 | Gibco | -- | |
| RNA提取 | mirVana RNA提取试剂盒 | Invitrogen | -- |
| DNA去除试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| cDNA合成 | 高容量cDNA反转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- |
| qRT-PCR | 罗氏Lightcycler 480 II实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- |
| 引物 | IDT | -- | |
| RNA-seq | Illumina TruSeq链特异性总RNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
| Illumina NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- | |
| 附着实验 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| OptiMEM培养基 | Gibco | -- | |
| siRNA | Horizon Discovery | -- | |
| BeWo细胞 | ATCC | -- | |
| EVOS显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 10%中性缓冲福尔马林 | Epridia | -- | |
| 微流控 | IbiFlow 0.4通道载玻片 | Ibidi | -- |
| Proteome Discoverer软件v2.1 | Thermo Scientific | -- | |
| 数据分析 | QuPath软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和处理 | 细胞类型、细胞密度、处理浓度、处理时间、对照设置 阅读提示：Materials and methods: Primary bovine endometrial cell culture, Human endometrial cell culture |
| RNA提取和qRT-PCR | RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、内参基因（GAPDH和ACTB）、qRT-PCR仪器、分析方法（2-ΔΔCt） 阅读提示：Materials and methods: RNA extraction, cDNA conversion, and qRT-PCR |
| RNA-seq | 样本选择、建库试剂盒、测序平台、分析阈值（log2FoldChange >1或<-1，padj<0.05） 阅读提示：Materials and methods: RNA sequencing and data analysis |
| 附着实验 | 细胞密度（Ishikawa 50,000细胞/孔）、siRNA浓度、转染时间、BeWo球状体生成条件、共培养时间、统计方法 阅读提示：Materials and methods: Attachment assays |
| 微流控 | 细胞类型、微流控装置（Ibidi 0.4通道）、处理浓度（100 μg/ml）、处理时间（24小时）、流速（1 μL/min）、质谱分析条件 阅读提示：Materials and methods: 2D microfluidics |