精子处理与分组
评估不同能量源对精子代谢的影响
采集种马精液，将精子稀释至25×10^6个/mL，在PBS或Tyrode's培养基中添加不同能量源（葡萄糖、乳酸、丙酮酸，单独或组合），37°C孵育2小时。
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利用NADH和FAD自身荧光通过流式细胞术对种马精子进行单细胞代谢分析
Single-cell metabolic profiling of stallion spermatozoa by flow cytometry using NADH and FAD autofluorescence†
实验完整度
高包含体外精子模型（不同能量源孵育）、功能验证（CASA、TMRM、刃天青氧化）、机制验证（FCCP、鱼藤酮、寡霉素处理）及患者样本（种马精子）。
主要模型
种马精子 体外孵育系统（PBS或Tyrode's培养基，含不同能量源）
重点核对
精子浓度：25×10^6个/mL 孵育时间：2小时，37°C 能量源浓度：葡萄糖、乳酸、丙酮酸均为5 mM 流式细胞术检测NADH和FAD荧光，使用ViaKrome 808评估细胞活力 使用FCCP、鱼藤酮和寡霉素验证代谢功能
摘要
使用流式细胞术检测NAD(P)H和FAD荧光，无需标记即可评估种马精子的代谢活性。将精子与不同的能量来源（葡萄糖、乳酸和丙酮酸）单独或组合孵育，测量NAD(P)H、FAD、NAD(P)H/FAD比值和光学氧化还原比值（ORR）。此外，还开发了一种基于刃天青还原和流式细胞术检测的代谢检测方法。观察到NAD(P)H和FAD荧光、NAD(P)H/FAD比值及ORR的变化。NAD(P)H/FAD比值显著升高，尤其是在葡萄糖和丙酮酸（P<0.0001）、葡萄糖和乳酸（P<0.0001）或所有三种底物同时存在时。还分析了线粒体活性指数（MAI）和运动效率（KE）。这两个指数与NADH/FAD比值呈正相关（0.6和0.7；P<0.00001），与ORR呈负相关（−0.6和−0.7；P<0.000001）。此外，利用流式细胞术通过刃天青还原评估了精子代谢不同底物的能力。结果表明，种马精子优先氧化葡萄糖、乳酸盐和α-酮戊二酸。总之，我们开发了一种简单的基于流式细胞术的氧化还原和代谢检测方法。结合刃天青还原试验，揭示了葡萄糖和乳酸盐氧化的偏好性。这表明存在特殊的代谢区室化，糖酵解发生在鞭毛，氧化磷酸化发生在线粒体。此外，该检测方法可能有助于临床精子评估，因为代谢变化常反映精子功能的生理改变。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何利用流式细胞术通过无标记检测NADH和FAD荧光，对种马精子进行单细胞代谢分析？
- 核心机制
- 种马精子优先氧化葡萄糖和乳酸盐，糖酵解发生在鞭毛，氧化磷酸化在线粒体，可能存在代谢区室化。
- 主要证据
- 不同能量源孵育后检测NADH/FAD比值和ORR变化，刃天青氧化实验显示葡萄糖和乳酸盐氧化增强，且KE和MAI与NADH/FAD比值正相关。
- 研究意义
- 该检测方法可用于临床精子评估，并有助于优化精子保存和体外受精培养基。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
流式细胞术检测NADH和FAD
无标记检测精子氧化还原状态
使用Cytoflex LX流式细胞仪，355nm激发检测NADH荧光（450/20 BP），405nm激发检测FAD荧光（550/40 BP），同时用ViaKrome 808评估活力，TMRM评估线粒体膜电位。
功能指标测定
评估精子运动性和线粒体功能
使用CASA系统分析精子运动参数（VCL、VSL、VAP、KE），使用TMRM计算线粒体活性指数（MAI）。
代谢氧化实验
评估精子对不同底物的氧化能力
在Tyrode's培养基中分别添加5 mM葡萄糖、果糖、乳糖、乳酸、丙酮酸和α-酮戊二酸，加入80 μM刃天青，37°C孵育30和60分钟，通过流式细胞术检测刃天青还原产物刃天青的荧光。
验证代谢功能
确认流式检测对线粒体功能变化的敏感性
使用FCCP（1-5 μM）解偶联线粒体，鱼藤酮（1 μM）抑制复合物I，寡霉素（10-30 μM）抑制ATP合酶，观察NADH和FAD荧光变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养、药物处理 | 磷酸盐缓冲液 | Sigma Aldrich | -- |
| 泰罗德培养基 | -- | -- | |
| 葡萄糖 | Sigma Aldrich | -- | |
| 乳酸 | Sigma Aldrich | -- | |
| 2-脱氧葡萄糖 | Sigma Aldrich | -- | |
| 鱼藤酮 | Sigma Aldrich | -- | |
| 寡霉素 | Sigma Aldrich | -- | |
| 果糖 | Sigma Aldrich | -- | |
| 乳糖 | Sigma Aldrich | -- | |
| α-酮戊二酸 | Sigma Aldrich | -- | |
| 刃天青 | Sigma Aldrich | -- | |
| 流式分析 | ViaKrome 808可固定活力染料 | Beckman Coulter | C36628 |
| 四甲基罗丹明甲酯 | Thermo Fisher | I34361 | |
| Cytoflex LX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| ImageStream X Mark II成像流式细胞仪 | Merck Millipore | -- | |
| 精子分析 | ISAS Proiser计算机辅助精子分析系统 | ISAS Proiser | -- |
| Leja计数板 | Leja | -- | |
| 奥林巴斯CX 41显微镜 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 精子处理与分组 | 精子浓度、孵育时间、能量源种类及浓度、培养基类型 阅读提示：Materials and methods, Experimental design |
| 流式细胞术检测 | 激光波长、滤光片、电压设置、抗体/染料用量 阅读提示：Materials and methods, Flow cytometry |
| 运动性分析 | CASA设置（帧率、分析细胞数）、温度、计数板深度 阅读提示：Materials and methods, Computer-assisted sperm analysis |
| 代谢氧化实验 | 底物浓度、刃天青浓度、孵育时间、检测通道 阅读提示：Materials and methods, Flow cytometry–based metabolite oxidation assay |
| 药物处理验证 | FCCP、鱼藤酮、寡霉素浓度及孵育时间 阅读提示：Materials and methods, Reagents and media; Experimental design |