基于NADH和FAD自发荧光的流式细胞术用于种马精子单细胞代谢分析

本研究使用流式细胞术，在不使用标记物的情况下检测NAD(P)H和FAD的荧光，以评估种马精子的代谢活性。精子分别与不同的能量源（葡萄糖、乳酸和丙酮酸）单独或组合孵育，并测量NAD(P)H、FAD、NAD(P)H/FAD比值和光学氧化还原比(ORR)。此外，还开发了一种基于刃天青还原和流式细胞术检测的代谢测定方法。观察到NAD(P)H和FAD荧光、NAD(P)H/FAD比值和ORR的变化。NAD(P)H/FAD比值显著增加，尤其是当葡萄糖和丙酮酸(P < 0.0001)、葡萄糖和乳酸(P < 0.0001)或所有三种底物(P < 0.0001)同时存在时。还分析了线粒体活性指数(MAI)和运动效率(KE)。这两个指数均与NADH/FAD比值呈正相关(0.6和0.7; P < 0.00001)，与ORR呈负相关(-0.6和-0.7; P < 0.000001)。此外，使用流式细胞术通过刃天青还原来评估精子代谢不同底物的能力。结果表明，种马精子优先氧化葡萄糖、乳酸和酮戊二酸。总之，我们开发了一种基于流式细胞术的简单氧化还原和代谢测定方法。该方法与刃天青还原测试相结合，揭示了精子对葡萄糖和乳酸氧化的偏好。这表明存在专门的代谢区室化，糖酵解发生在鞭毛，而氧化磷酸化发生在线粒体中。此外，该测定方法可能有助于临床精子评估，因为代谢变化通常反映精子功能的生理改变。