FLCN表达分析
比较不同乳腺癌亚型中FLCN及其结合伴侣的表达水平
利用TCGA数据库和PDX样本分析FLCN、FNIP1、FNIP2的表达，并通过免疫印迹和免疫组化验证蛋白水平。
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卵泡素通过抑制TFE3依赖的Warburg效应和血管生成的诱导来抑制乳腺肿瘤生长
Folliculin impairs breast tumor growth by repressing TFE3-dependent induction of the Warburg effect and angiogenesis
实验完整度
高包含TCGA/PDX样本分析、细胞系体外功能实验、异种移植瘤体内实验、RNA-seq及机制验证，多层级证据。
主要模型
MCF7和T47D管腔型乳腺癌细胞系 MDA-MB-436和Hs578T基底样乳腺癌细胞系 NSG小鼠异种移植瘤模型 乳腺癌患者来源异种移植瘤(PDX)模型
重点核对
FLCN敲除细胞系通过CRISPR/Cas9生成，并使用4个克隆混合以排除克隆效应 MCF7和T47D细胞注入NSG小鼠乳腺脂肪垫，每只注射5×10^6个细胞，β-雌二醇每周皮下注射1 μg TFE3敲低使用siRNA或shRNA，siRNA浓度为10 nM，shRNA慢病毒载体 实验重复次数：体外实验至少3次，每次三重复；体内实验每组10只小鼠
摘要
生长中的肿瘤存在于代谢受限的环境中，需要激活多种途径来获取营养以支持加速的生长速率。卵泡素（FLCN）肿瘤抑制复合物（FLCN、FNIP1、FNIP2）通过两个代谢主激酶AMPK和mTORC1参与能量稳态的调节。FLCN肿瘤抑制复合物的功能缺失突变仅在罕见的Birt-Hogg-Dube综合征患者的肾肿瘤中报道。在此，我们揭示了FLCN、FNIP1和FNIP2在许多人类癌症中下调，包括预后差的侵袭性基底样乳腺癌，其中AMPK和TFE3靶标与管腔型、侵袭性较小的亚型相比被激活。管腔型乳腺癌中FLCN缺失通过TFE3激活及随后诱导多种途径（包括自噬、溶酶体生物发生、有氧糖酵解和血管生成）促进肿瘤生长。引人注目的是，FLCN缺陷细胞中有氧糖酵解和血管生成的诱导由PGC-1α/HIF-1α通路的激活所决定，我们证明该通路是TFE3依赖的，直接将TFE3与Warburg代谢重编程和血管生成联系起来。相反，在侵袭性基底样乳腺癌模型中过表达FLCN减弱了TFE3核定位、TFE3依赖的转录活性和肿瘤生长。这些发现支持失调的FLCN/TFE3肿瘤抑制通路在人类癌症中的普遍作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FLCN在乳腺癌中是否通过TFE3调节肿瘤生长和代谢重编程？
- 核心机制
- FLCN缺失导致TFE3核易位和激活，进而上调PGC-1α/HIF-1α通路，促进有氧糖酵解、氧化磷酸化和血管生成，从而增强肿瘤生长。
- 主要证据
- 在MCF7和T47D细胞中敲除FLCN后，TFE3核定位增加，糖酵解和线粒体呼吸增强，ATP产生增加；体内实验中FLCN敲除肿瘤生长加速，血管生成标志物升高；TFE3敲低或FLCN回补逆转这些效应。
- 研究意义
- 该研究揭示了FLCN/TFE3通路在乳腺癌中的抑癌作用，为基底样乳腺癌提供了潜在的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
FLCN敲除细胞系建立
在管腔型乳腺癌细胞系中敲除FLCN以研究其功能
使用CRISPR/Cas9技术敲除MCF7和T47D中的FLCN，通过免疫印迹验证敲除效率。
体外代谢和功能分析
评估FLCN缺失对细胞代谢、自噬、溶酶体活性和TFE3转录活性的影响
测量ATP水平、葡萄糖消耗、乳酸产生、ECAR和OCR，并检测TFE3核定位和靶基因表达。
体内肿瘤生长实验
验证FLCN缺失对体内肿瘤生长的影响及TFE3依赖性
将MCF7和T47D细胞（WT、FLCNKO、FLCNKO+shTFE3）注射到NSG小鼠乳腺脂肪垫，监测肿瘤生长，并通过免疫组化分析TFE3、VEGF-A和CD31表达。
机制研究
阐明TFE3调控PGC-1α/HIF-1α通路的机制
通过siRNA敲低TFE3、PGC-1α或HIF-1α，检测下游靶基因表达，并测量ROS水平。
FLCN过表达实验
验证FLCN过表达对基底样乳腺癌细胞和肿瘤生长的影响
在MDA-MB-436和Hs578T细胞中稳定过表达FLCN，检测TFE3核定位、靶基因表达和细胞增殖，并进行体内肿瘤生长实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Wisent | 319-005CL |
| 胎牛血清 | Wisent | 080-150 | |
| 青霉素/链霉素 | Wisent | 450-201-EL | |
| 庆大霉素 | Wisent | 450-135 | |
| 基因沉默 | Lipofectamine RNAiMax转染试剂 | Invitrogen | 13778030 |
| siRNA SMARTpool (人TFE3) | Dharmacon | L-00933-00-0005 | |
| siRNA (人PPARGC1A) | QIAGEN | -- | |
| siRNA SMARTpool (人HIF-1α) | Dharmacon | L-004018-00-0005 | |
| siRNA对照 | Dharmacon | D-001810-10-05 | |
| 基因敲低 | Mission慢病毒shRNA空载体 | Sigma-Aldrich | -- |
| shTFE3 | Sigma-Aldrich | TRCN0000232151 | |
| 基因过表达 | pLenti CW57-MCS1-P2A-MCS2-BLAST质粒 | Addgene | 80921 |
| CRISPR敲除 | lentiCRISPR质粒 | Addgene | 49535 |
| 病毒包装 | VSV-G包膜质粒 | Addgene | 12259 |
| 包装质粒 | Addgene | 12260 | |
| Lipofectamine LTX转染试剂 | Invitrogen | 15338-500 | |
| 药物处理 | N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A7250 |
| 动物实验 | β-雌二醇 | Sigma-Aldrich | E8875 |
| 免疫印迹 | β-actin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 |
| AMPKα抗体 | Cell Signaling Technology | 2532 | |
| FLCN抗体 | Cell Signaling Technology | 3967 | |
| FNIP1抗体 | Abcam | ab61395 | |
| FNIP2抗体 | Sigma-Aldrich | SAB3500010 | |
| p-AMPKα (Thr172)抗体 | Cell Signaling Technology | 2531 | |
| ACC抗体 | Cell Signaling Technology | 3676 | |
| p-ACC (S79)抗体 | Cell Signaling Technology | 3661 | |
| GPNMB抗体 | Cell Signaling Technology | 38313 | |
| TFE3抗体 | Cell Signaling Technology | 14779S | |
| TFE3抗体（用于IHC） | Sigma-Aldrich | HPA023881 | |
| 免疫组化 | F4/80抗体 | Cell Signaling Technology | 70076 |
| Cleaved caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| CD31抗体 | Dianova | AF5149-01 | |
| CD31抗体 | Cell Signaling Technology | 77699 | |
| Ki67抗体 | Cell Signaling Technology | 9449 | |
| VEGF-A抗体 | Dako Technology | M7273 | |
| 荧光素酶报告实验 | 4XCLEAR-luciferase报告质粒 | Addgene | 66800 |
| pGL2-TK-HRE质粒 | NCI（赠品） | -- | |
| CMV-Renilla荧光素酶质粒 | Promega | E2261 | |
| 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 23966-1 | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1980 | |
| FLUOstar Omega酶标仪 | BMG Labtech | -- | |
| 溶酶体活性检测 | DQ Red BSA | Thermo Fisher Scientific | D12051 |
| RT-qPCR | 总RNA提取试剂盒 | Geneaid | -- |
| SuperScript III反转录试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| SYBR Green qPCR预混液 | Invitrogen | -- | |
| AriaMAX实时荧光定量PCR仪 | Agilent Technologies | -- | |
| 代谢分析 | NOVA生化分析仪 | NOVA Biomedical | -- |
| Eton Bioscience试剂盒 | Eton Bioscience | -- | |
| XF96细胞外流量分析仪 | Seahorse Bioscience | -- | |
| ATP检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| 免疫组化 | Ventana BenchMark ULTRA染色系统 | Roche | -- |
| OmniMap抗兔HRP二抗 | Roche | -- | |
| DAB显色液 | Roche | -- | |
| Imagescope软件 | Aperio | -- | |
| ELISA | 人VEGF-A定量ELISA试剂盒 | R&D Systems | DVE00 |
| 多重细胞因子检测 | Bio-Plex 200系统 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| Milliplex小鼠细胞因子/趋化因子检测试剂盒 | Millipore | -- | |
| 动物实验 | 基质胶 | Corning | 354248 |
| NSG小鼠 | Jackson Laboratory | 005557 | |
| ROS检测 | CM-H2DCFDA探针 | Invitrogen | -- |
| 细胞增殖 | IncuCyte活细胞分析系统 | Sartorius | -- |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| QIAGEN RNeasy纯化柱 | QIAGEN | -- | |
| RNA-seq分析 | Trimmomatic软件 | -- | -- |
| STAR软件 | -- | -- | |
| HTSeq软件 | -- | -- | |
| limma (R包) | -- | -- | |
| 基因集富集分析 | Enrichr工具 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基含10% FBS，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，50 μg/mL庆大霉素；5% CO2, 37°C。 阅读提示：Methods: Cell lines and cell culture |
| FLCN敲除 | CRISPR/Cas9 guide RNA序列：TCGCACATGTCCGACTTTTT和GCGGGCTGCTGGACTCGACGC；使用lentiCRISPR质粒；单克隆筛选后混合4个克隆。 阅读提示：Methods: Generation of knockout lines |
| 基因沉默 | siRNA转染浓度10 nM，使用Lipofectamine RNAiMax；shRNA慢病毒载体用于稳定敲低。 阅读提示：Methods: Cell lines and cell culture |
| 代谢测定 | Seahorse实验：细胞接种10,000细胞/孔，非缓冲DMEM含25 mM葡萄糖和2 mM谷氨酰胺，2小时预平衡。 阅读提示：Methods: Metabolic assays |
| 动物实验 | NSG雌性小鼠，6-8周龄；每只注射5×10^6细胞于第四乳腺脂肪垫；β-雌二醇每周皮下注射1 μg；肿瘤体积每周测量。 阅读提示：Methods: Mammary fat pad injections; Figure 4 legend |
| 免疫组化 | 使用Ventana BenchMark ULTRA系统；抗原修复CC1缓冲液95°C 44分钟；一抗37°C 32分钟；DAB显色8分钟。 阅读提示：Methods: IHC |
| VEGF-A定量 | 使用Human VEGF-A Quantikine ELISA kit测定条件培养基或肿瘤裂解液中的VEGF-A水平。 阅读提示：Methods: Quantification of soluble VEGF-A |