建立小鼠结直肠癌肝转移模型
建立模拟结直肠癌肝转移的动物模型，用于评估后续治疗效果。
向7-8周龄雄性BALB/c小鼠脾内注射1.4×10^5 CT26细胞（悬浮于200µL PBS），通过H&E染色验证肝转移灶的形成。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
表达IL-21的牛痘病毒可通过静脉注射治愈小鼠结直肠癌肝转移
Vaccinia virus armed with IL-21 can cure murine colorectal cancer liver metastases via intravenous administration
实验完整度
高体外细胞实验、小鼠疾病模型、流式细胞术、IFN-γ释放实验、RNA-seq及生物信息学分析等多个独立证据层级，并包含功能验证和机制验证。
主要模型
CT26小鼠结直肠癌细胞系 BALB/c小鼠结直肠癌肝转移模型 BALB/c小鼠
重点核对
VVLΔTK-STCΔN1L-mIL21给药剂量为2×10^8 PFU，尾静脉注射 治疗时间点为第7、9、11、21、23、25天 肝转移模型通过脾内注射1.4×10^5 CT26细胞建立 生存分析每组11只小鼠 RT-qPCR检测病毒拷贝数，使用VLTF基因特异性引物
摘要
背景
结直肠癌肝转移是结直肠癌患者死亡的主要原因之一。溶瘤病毒免疫疗法在肿瘤治疗中显示出巨大潜力；然而，目前大多数溶瘤病毒通过瘤内注射给药，限制了其更广泛的临床应用。
方法
在本研究中，我们使用表达白细胞介素-21的溶瘤牛痘病毒VVLΔTK-STCΔN1L-mIL21，通过静脉注射治疗雄性BALB/c小鼠结直肠癌肝转移模型。该方法旨在探索溶瘤病毒通过全身给药到达远处肿瘤并发挥治疗作用的可行性，从而拓宽溶瘤病毒的应用范围。我们检测了静脉注射牛痘病毒治疗对结直肠癌肝转移小鼠生存期的影响。此外，我们通过流式细胞术、体外干扰素（IFN）-γ释放实验和RNA测序，全面分析了牛痘病毒治疗对这些小鼠T淋巴细胞的影响。
结果
我们的研究结果显示，VVLΔTK-STCΔN1L-mIL21经静脉给药后成功到达肝肿瘤灶并持续存在较长时间，显著延长了结直肠癌肝转移小鼠的生存期。进一步分析表明，VVLΔTK-STCΔN1L-mIL21治疗促进了CD8+ T细胞和效应记忆T细胞（CD8+CD44hiCD62Llo TEM）的扩增，同时减少了调节性T细胞。它还增强了脾脏CD45+淋巴细胞在体外的IFN-γ分泌，抑制了CD8+ T细胞上免疫检查点分子和效应分子的表达，并促进了滤泡辅助性T细胞的生成。
结论
VVLΔTK-STCΔN1L-mIL21可通过尾静脉注射有效到达肝转移灶并发挥强效抗肿瘤作用，显著延长小鼠生存期。
关键词：结直肠癌、免疫疗法、记忆、T细胞
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探讨表达IL-21的溶瘤牛痘病毒VVLΔTK-STCΔN1L-mIL21经静脉注射能否有效治疗小鼠结直肠癌肝转移。
- 核心机制
- VVLΔTK-STCΔN1L-mIL21通过促进CD8+ T细胞和CD8+CD44hiCD62Llo TEM细胞扩增、减少Treg细胞、抑制CD8+ T细胞免疫检查点分子（Pdcd1、Lag3、Vista）及效应分子（Gzma、Gzmb、Fasl）表达、增强IFN-γ分泌、促进Tfh细胞生成，并维持病毒在肿瘤组织中的高拷贝持续存在，从而发挥抗肿瘤作用。
- 主要证据
- 在CT26脾内注射建立的BALB/c小鼠肝转移模型中，尾静脉注射VVLΔTK-STCΔN1L-mIL21显著延长小鼠生存期（n=11，2只治愈），肝内病毒拷贝数显著高于对照病毒并持续至第18天。流式细胞术显示CD8+ T及TEM细胞增加、Treg减少；体外IFN-γ释放实验显示CD45+细胞应答增强；RNA-seq显示CD8+ T细胞激活、免疫检查点抑制，CD4+ T细胞Tfh分化增加。
- 研究意义
- 该研究表明，静脉注射表达IL-21的溶瘤病毒可有效到达远处肿瘤并长期局部存在，为结直肠癌、其他实体瘤及转移性肿瘤患者提供了一种潜在的治疗选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
静脉注射溶瘤病毒治疗
评估VVLΔTK-STCΔN1L-mIL21经尾静脉注射对CRLM小鼠的治疗效果。
在模型建立后第7、9、11、21、23、25天，通过尾静脉注射PBS、2×10^8 PFU/140µL的VVLΔTK-STCΔN1L或VVLΔTK-STCΔN1L-mIL21，并监测小鼠生存期。
检测病毒在肝脏的分布与持久性
验证静脉注射后病毒能否到达肝转移灶并持续存在。
在第7、9、11天给予病毒治疗后，于第14和18天收集肝脏，提取基因组DNA，通过qPCR（RT-qPCR）检测VLTF基因拷贝数。
流式细胞术分析免疫细胞亚群
评估病毒治疗对肝和脾中T细胞、树突状细胞和巨噬细胞亚群的影响。
在第14和18天收集肝和脾组织，制备单细胞悬液，用特异性抗体染色，通过流式细胞术分析CD8+ T、CD4+ T、Treg、TEM、树突状细胞、巨噬细胞等亚群。
体外IFN-γ释放实验
评估脾细胞在体外对抗原刺激的响应能力，反映T细胞功能。
从脾脏中分离CD45+细胞，与CT26细胞、KRAS、GP70和B8R肽共孵育72小时，通过ELISA检测上清中IFN-γ的水平。
CD8+和CD4+ T细胞的RNA-seq分析
全局分析病毒治疗对CD8+和CD4+ T细胞基因表达及信号通路的影响，揭示机制。
在第18天收集脾脏，使用磁珠分选CD8+和CD4+ T细胞，进行转录组测序，并进行差异表达基因筛选、GO富集分析和CIBERSORT免疫浸润分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 动物实验 | 阿佛丁 | -- | -- |
| 病毒检测 | Fast Pure细胞/组织DNA提取迷你试剂盒 | Vazyme | DC102-01 |
| StepOnePlus实时荧光定量PCR系统 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | CD45-PerCP抗体 | BioLegend | 103130 |
| CD3-PE/Cyanine7抗体 | BioLegend | 100220 | |
| CD8a-FITC抗体 | BioLegend | 100706 | |
| CD4-BV510抗体 | BioLegend | 100449 | |
| CD62L-PE抗体 | BioLegend | 100408 | |
| CD127-BV711抗体 | BioLegend | 135035 | |
| CD25-BV421抗体 | BioLegend | 102034 | |
| CD11b-FITC抗体 | BioLegend | 101206 | |
| F4/80-PE/Cyanine7抗体 | BioLegend | 123114 | |
| MHCII-BV605抗体 | BioLegend | 107639 | |
| CD163-PE/Dazzle 594抗体 | BioLegend | 155315 | |
| CD3-BV510抗体 | BioLegend | 100233 | |
| CD49b-APC抗体 | BioLegend | 103515 | |
| Gr1-PE抗体 | BioLegend | 108407 | |
| CD11C-BV711抗体 | BioLegend | 117349 | |
| BD FACS Aria III流式细胞仪 | BD | -- | |
| IFN-γ释放实验 | CD45小鼠磁珠 | Miltenyi | 130-052-301 |
| 小鼠IFN-γ未包被ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-7314-88 | |
| RNA-seq | CD8a (Ly2)小鼠磁珠 | Miltenyi | 130-117-044 |
| CD4 (L3T4)小鼠磁珠 | Miltenyi | 130-117-043 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系：BALB/c，雄性，7-8周龄；麻醉剂Avertin剂量：0.45 mg/g体重；CT26细胞剂量：1.4×10^5个/200µL PBS；注射途径：脾内注射 阅读提示：Materials and methods - Murine colorectal cancer liver metastases models establishment |
| 药物治疗方案 | 病毒剂量：2×10^8 PFU/140µL；给药途径：尾静脉注射；给药时间点：第7、9、11、21、23、25天；对照组：PBS、VVLΔTK-STCΔN1L 阅读提示：Materials and methods - Survival analysis |
| 病毒拷贝数检测 | 治疗时间：第7、9、11天；检测时间：第14和18天；DNA提取试剂盒：Fast Pure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit；qPCR引物和探针：VLTF基因特异性 阅读提示：Materials and methods - RT-qPCR |
| 流式细胞术分析 | 治疗时间：第7、9、11天；检测时间：第14和18天；抗体组合（T细胞、髓系细胞）；仪器：BD FACS Aria III 阅读提示：Materials and methods - Flow cytometry |
| IFN-γ释放实验 | CD45+细胞分离：CD45 MicroBeads；刺激物：MMC-CT26、KRAS (GADGVGKSA)、GP70 (SPSSYVYHQF)、B8R (TSYKFESV)；孵育时间：72小时；ELISA试剂盒：Mouse IFN-γ uncoated ELISA kit 阅读提示：Materials and methods - Interferon-γ release assay |
| RNA-seq | CD8+和CD4+ T细胞分离：磁珠分选；测序时间：第18天；差异表达基因筛选标准：|log2FC|>1 (CD8) 或 >0.5 (CD4), p<0.05 阅读提示：Materials and methods - Transcriptome sequencing and Bioinformatics analysis |