队列样本收集与多组学数据生成
获取AD患者皮损、非皮损和健康对照皮肤样本，并进行DNA甲基化、转录组和微生物组分析。
从MAARS队列收集皮肤活检样本，提取DNA和RNA，分别使用Illumina MethylationEPIC v2 BeadChip和Affymetrix Human Gene 2.1 ST arrays进行甲基化和转录组分析，并对后大腿皮肤拭子进行16S rRNA基因测序分析微生物组。
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整合甲基化组-转录组分析揭示特应性皮炎中的表观基因组重塑和Rho GTP酶相关的免疫-上皮细胞串扰
Integrated Methylome-Transcriptome Analysis Reveals Epigenomic Remodeling and Rho GTPase-Linked Immune-Epithelial Crosstalk in Atopic Dermatitis
实验完整度
高研究整合了皮肤甲基化组、转录组和微生物组数据，并用多种细胞类型校正模型进行验证，包含DMR鉴定、WGCNA整合和S. aureus相关分析，但缺乏体外或动物模型功能实验。
主要模型
特应性皮炎患者的皮肤活检样本（皮损和非皮损） 健康对照皮肤活检样本 金黄色葡萄球菌定植分类的AD皮损皮肤
重点核对
样本来源：欧洲MAARS队列，后大腿皮肤活检，AD_LES (n=40), AD_NL (n=38), CTRL_NL (n=40) 细胞类型校正：采用甲基化来源的9细胞模型和转录组来源的12细胞模型 DMR鉴定标准：HMFDR < 0.05且|Δβ| > 0.05 S. aureus分类：相对丰度分为absent (n=9)和dominant (n=15) 统计模型：limma线性模型，校正机构、年龄、性别、技术协变量及细胞类型比例
摘要
背景：特应性皮炎（AD）是一种慢性炎症性皮肤病，其特征在于免疫失调和上皮屏障功能障碍。尽管AD皮肤中的转录变化已日益明确，但DNA甲基化模式仍了解较少。方法：在此，我们利用互补的细胞类型校正模型，对来自皮损（n=40）、邻近非皮损（n=38）和健康对照（n=40）皮肤的匹配DNA甲基化组、转录组和微生物组进行了整合分析。结果：我们在所有成对比较中鉴定了数千个差异甲基化区域（DMRs）（皮损与健康：n=13,514；皮损与非皮损：n=4,591；非皮损与健康：n=1,716），包括高甲基化和低甲基化区域，且效应大小平衡。在基于甲基化的校正后，一组核心DMR仍然存在，而广泛的皮损与非皮损差异主要受细胞组成驱动。与转录组共表达网络的整合将DMR与免疫-上皮模块联系起来，225个DMR-基因对显示出显著的反向相关（FDR < 0.05）。以金黄色葡萄球菌优势定植的皮损皮肤与未定植皮肤相比，在92个DMR上存在差异，其中70个也与局部严重程度重叠。通路分析一致地突出了Rho GTP酶和肌动蛋白-连接程序，表明Rho GTP酶信号传导是AD中免疫、上皮和微生物相互作用的核心整合因子。结论：我们的研究强调了表观基因组重塑在AD中的重要性，并为慢性炎症性皮肤病的精准干预提供了潜在途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 特应性皮炎皮肤中DNA甲基化模式如何改变，以及这些变化与转录组和微生物组有何关联？
- 核心机制
- Rho GTPase信号通路及肌动蛋白-连接程序在多个分析层面反复富集，可能作为整合免疫、上皮和微生物相互作用的核心枢纽。
- 主要证据
- 整合甲基化组、转录组和微生物组分析发现数千个DMRs；WGCNA模块与DMR相关；225个DMR-基因对显著反相关；S. aureus相关DMRs与疾病严重度相关。
- 研究意义
- 本研究强调表观基因组重塑在AD发病中的重要性，并指出可能用于慢性炎症性皮肤病精准干预的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
差异甲基化区域（DMR）鉴定
比较不同组间DNA甲基化差异，并评估细胞类型校正的影响。
使用DMRcate包，结合limma线性模型，在三种模型（basic, 9-cell, 12-cell）下进行DMR分析，并比较不同模型下DMR的显著性。
转录组共表达网络分析（WGCNA）
鉴定与疾病状态相关的基因共表达模块，并后续与甲基化数据整合。
对转录组数据中前5000个最可变基因进行WGCNA分析，构建共表达模块，并计算模块特征基因与临床特征的关联。
甲基化-转录组整合分析
探究DNA甲基化与基因表达之间的关联。
计算DMR β值与WGCNA模块特征基因的相关性，并识别显著相关的DMR-模块对；同时进行DMR与邻近基因表达的直接相关性分析。
微生物组关联分析（S. aureus）
评估金黄色葡萄球菌定植状态是否与AD皮损皮肤DNA甲基化差异相关。
将AD皮损样本根据S. aureus相对丰度分为absent和dominant组，使用limma比较两组间的DMR水平差异，并进一步分析与疾病严重度的相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
转录组分析
细胞类型反卷积
微生物组分析
功能富集分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本保存 | RNAlater | Sigma-Aldrich | -- |
| DNA甲基化芯片 | Illumina Infinium MethylationEPIC v2 BeadChip | Illumina | -- |
| 转录组芯片 | Affymetrix Human Gene 2.1 ST 芯片 | Affymetrix | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 样本来源：欧洲MAARS队列；样本类型：后大腿皮肤活检，皮损（AD_LES, n=40）、非皮损（AD_NL, n=38）和健康对照（CTRL_NL, n=40）；保存于RNAlater。 阅读提示：2. Materials and Methods, 2.1 Cohort Description and Study Participants |
| DNA甲基化分析 | 芯片类型：Illumina Infinium MethylationEPIC v2 BeadChip；数据分析流程：minfi, Enmix, Noob标准化；DMR分析：DMRcate，λ=1000, C=2；显著性阈值：HMFDR < 0.05, |Δβ| > 0.05。 阅读提示：2.2 DNA Methylation Analysis, 2.4 Differentially Methylated Region (DMR) Analysis |
| 细胞类型校正 | 使用EpiDISH和EpiSCORE估计甲基化细胞组分，使用CIBERSORTx估计转录组免疫细胞组分；模型包括9-cell和12-cell。 阅读提示：2.6, 2.7 |
| S. aureus分析 | S. aureus分组：absent (n=9) vs dominant (n=15)；模型校正：limma，包含机构、年龄、性别、技术协变量和12个免疫细胞类型；显著性阈值：FDR < 0.05, |Δβ| > 0.05。 阅读提示：2.11 Microbiome-Associated Methylation Analysis |
| 统计模型 | 模型校正因素：机构、年龄、性别、技术协变量（Sample_Plate/Chip/Well）和细胞类型比例；多重检验校正：Benjamini-Hochberg FDR。 阅读提示：2.3 and 2.4 |