样本收集与准备
获取临床来源的人肾组织和活检组织用于空间转录组分析
收集4例肾切除术的未受累肾组织和1例肾细胞癌组织，固定于福尔马林并石蜡包埋成多组织块；另收集14例微小病变病患者的活检组织，其中3例正常组织作为对照。
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临床来源人组织空间转录组学的严谨性与可重复性
Rigor and Reproducibility of Spatial Transcriptomics Performed on Clinically Sourced Human Tissues
实验完整度
高包含多组织块及临床活检的DSP重复性实验、多种归一化方法比较、CTA与WTA灵敏度比较、GeoMx与CosMx平台比较，涉及体内样本和体外分析，并有功能验证（如细胞反卷积）和平台间验证。
主要模型
人肾切除术多组织块（4例正常肾和1例肾细胞癌） 临床来源的人肾活检组织（3例正常，MCD患者活检） 人肾组织切片（FFPE）
重点核对
探针混合液体积100μL vs 250μL，盖玻片22×22mm vs 40×22mm 归一化方法（Q3、循环loess、分位数）的选择 CTA（1811基因）和WTA（~18000基因）探针集灵敏度差异 GeoMx ROI大小与CosMx伪ROI的匹配
摘要
空间转录组分析能够精确量化基因表达，同时将表达谱定位到组织结构上。这些方法的几种实现已作为商业化平台发布，将使多个实验室能够增进我们对人类疾病机制的理解。将这些方法应用于临床试验或作为实验室开发测试以辅助疾病诊断也有浓厚的兴趣。然而，在这些技术被广泛用于临床研究和诊断之前，有必要彻底了解它们在真实世界条件下的性能。在本研究中，我们主要针对一种广泛使用的空间转录组学方法——数字空间 profiling（DSP），审查其技术可重复性、数据归一化方法和检测灵敏度。我们还将它与具有单细胞分辨率的新平台单分子成像仪（SMI）进行了比较。以临床来源的人肾组织和活检组织为范例，我们发现DSP表现出高度的严谨性和可重复性。我们证明归一化方法可以影响空间转录组学数据的生物学解释。虽然多细胞和单细胞分辨率方法之间存在良好的一致性，但在成本、执行时间和检测灵敏度方面存在权衡，这可能影响选择哪种方法。我们的研究为将空间转录组学方法纳入临床工作流程奠定了实践基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 空间转录组学平台（GeoMx DSP和CosMx SMI）在临床来源人组织中的技术可重复性、数据归一化方法的影响以及检测灵敏度如何，从而评估其是否适合临床工作流程？
- 核心机制
- 空间转录组学数据中的变异主要源于组织学差异（84.5%），其次是供体间差异（7.3%）和ROI选择变异（6.1%），而技术变异（存储和采集时间）仅占2.0%；归一化方法（分位数、循环loess）能更有效地降低技术变异并影响生物学解释和DEG检测。
- 主要证据
- 使用GeoMx DSP在4天内交错收集重复切片数据，进行PCA、标准偏差分布和MA图分析；比较了Q3、循环loess、分位数等归一化方法对差异表达基因和GO富集的影响；使用WTA探针集与CTA比较，发现WTA灵敏度约为CTA的13%，两者表达相关性r=0.83；使用CosMx SMI进行单细胞分析，与GeoMx比较共450个基因，相关性r=0.68。
- 研究意义
- 该研究为空间转录组学方法在临床工作流程中的应用奠定了实践基础，强调了实验设计考虑因素（如归一化方法、探针集选择、平台选择）对灵敏度、成本和临床翻译的影响。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
DSP可重复性实验
评估GeoMx DSP平台的技术可重复性，包括交错样本采集和探针体积优化
从多组织块制备4张连续切片，使用CTA探针（1811基因）杂交，每张使用100μL探针混合液和22×22mm盖玻片；在4天内交错采集ROI，生成测序文库并测序。
数据归一化方法比较
评估不同归一化方法对技术变异去除和生物学解释的影响
使用GeomxTools包处理DSP数据，应用不同归一化方法（管家基因、Q3、RUV-III、循环loess、分位数），通过MA图、RLE图、PCA、差异表达基因和GO富集分析比较性能。
灵敏度比较：CTA vs WTA
比较GeoMx平台上CTA和WTA探针集的检测灵敏度
在3例正常肾活检的样本上使用WTA探针集进行DSP实验，并与先前CTA实验数据比较。计算检测到基因数量、重叠基因的表达相关性和灵敏度差异。
灵敏度比较：GeoMx vs CosMx
比较GeoMx DSP和CosMx SMI平台的检测灵敏度和结果一致性
在多组织块切片上使用CosMx SMI的1000基因面板进行单细胞空间转录组分析，定义伪ROI与GeoMx ROI对应，整合共享基因计数并进行相关性分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织处理 | 10%中性缓冲福尔马林 | -- | -- |
| 70%乙醇 | -- | -- | |
| 切片和脱蜡 | 带电荷载玻片 | -- | -- |
| 抗原修复 | Tris EDTA缓冲液（pH 9） | -- | -- |
| 蛋白酶K | -- | -- | |
| 杂交 | HybriSlip盖玻片 | ThermoFisher | -- |
| 免疫荧光染色 | 抗泛细胞角蛋白抗体 | -- | -- |
| 抗CD10抗体 | -- | -- | |
| Syto13染料 | -- | -- | |
| 测序 | SeqCode文库构建试剂盒 | NanoString | -- |
| NextSeq 2000 P2流动槽 | -- | -- | |
| CosMx实验 | CosMx SMI平台 | NanoString | -- |
| 1000基因通用细胞表征面板 | NanoString | -- | |
| 抗泛细胞角蛋白抗体 | -- | -- | |
| 抗CD45抗体 | -- | -- | |
| 抗β2微球蛋白抗体 | -- | -- | |
| 抗CD298抗体 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 组织处理与固定 | 固定时间（24-48小时）、乙醇脱水时间（24小时）、石蜡包埋条件 阅读提示：Methods: Human nephrectomy tissues |
| DSP杂交步骤 | 探针体积（100μL vs 250μL）、盖玻片尺寸（22×22mm vs 40×22mm）、杂交时间（过夜）和温度（37°C） 阅读提示：Methods: Digital spatial profiling to reduce reagent utilization |
| 归一化方法 | 所采用的归一化方法（Q3、循环loess、分位数等）及其参数（如循环loess的迭代次数） 阅读提示：Methods: Initial data processing; Results: Comparison of data normalization approaches |
| 探针集选择 | 探针集类型（CTA 1811基因 vs WTA ~18000基因）以及每基因探针数（CTA 5探针/基因，WTA 1探针/基因） 阅读提示：Methods: Sensitivity comparison: CTA vs. WTA |
| CosMx实验 | 基因面板（1000基因）、字段数（205）、细胞分割和细胞分型参数 阅读提示：Methods: Sensitivity comparison: GeoMx vs. CosMx |
| 统计分析 | DEG阈值（FDR<0.05，fold change>1.5）、细胞反卷积使用SpatialDecon算法和KPMP参考数据 阅读提示：Methods: Initial data processing; Results: Impact of data normalization approaches |