TMPRSS2抑制剂的体外酶学筛选
评估12种N-0385/N-0920类似物对TMPRSS2的抑制活性，筛选出最有效的化合物。
使用纯化的重组TMPRSS2和荧光底物Boc-QAR-AMC，测定化合物的IC50、IC90和Ki值，并进行缓慢结合动力学分析。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
对SARS-CoV-2（JN.1）和甲型流感（H1N1）具有广谱效力的TMPRSS2抑制剂可保护小鼠免受甲型流感感染
TMPRSS2 inhibitors with broad-spectrum efficacy against SARS-CoV-2 (JN.1) and influenza A (H1N1) viruses protect mice from influenza A infection
实验完整度
高包含体外酶学抑制、细胞水平抗病毒验证、气液界面培养模型、小鼠体内攻毒保护实验及联合用药分析，涉及功能与机制验证。
主要模型
Calu-3人肺上皮细胞 人鼻上皮细胞气液界面（ALI）培养模型 BALB/c小鼠流感感染模型
重点核对
TMPRSS2抑制活性验证（IC50、Ki值） 化合物在Calu-3细胞中对IAV H1N1和SARS-CoV-2 JN.1的EC50 ALI培养模型中感染抑制效果 小鼠模型中生存率、体重变化及肺病毒滴度 与巴洛沙韦联合用药的协同作用
摘要
人TMPRSS2是一种II型跨膜丝氨酸蛋白酶，是SARS-CoV-2和甲型流感病毒（IAV H1N1）感染所必需的宿主因子。它促进病毒表面糖蛋白的切割，这是膜融合所必需的。这一重要性使其成为宿主定向抗病毒疗法的有吸引力的靶标。我们先前鉴定了N-0385和N-0920为纳摩尔级TMPRSS2抑制剂，并证明了它们对多种SARS-CoV-2变异株的抗病毒效力。在此，我们筛选了另外12种具有改善药代动力学特性的N-0385/N-0920类似物。化合物9和10对TMPRSS2活性和病毒进入表现出强烈抑制作用：它们在Calu-3细胞中阻断了假病毒和真实SARS-CoV-2 JN.1及IAV H1N1。化合物9在IAV H1N1感染期间与巴洛沙韦表现出协同作用。两种化合物均高度降低了气液界面培养物和小鼠模型中的H1N1感染，从而突出了其广谱抗病毒潜力。发现针对当前和新出现的人类病毒的广谱、宿主定向抗病毒药物对于为未来的大流行做准备至关重要。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 筛选具有改善药代动力学特性的N-0385/N-0920类似物，并评估其对SARS-CoV-2 JN.1和甲型流感H1N1的广谱抗病毒效力。
- 核心机制
- 通过抑制宿主TMPRSS2蛋白酶活性，阻断病毒表面糖蛋白（HA和S蛋白）的切割，从而抑制病毒进入宿主细胞。
- 主要证据
- 化合物9和10在体外抑制TMPRSS2酶活性（IC50分别为1.7和1.1 nM），在Calu-3细胞和ALI培养模型中阻断IAV H1N1和SARS-CoV-2 JN.1感染，并在小鼠模型中降低发病率、死亡率和肺病毒载量。
- 研究意义
- 化合物9和10可作为广谱、宿主定向的抗病毒候选药物，用于预防和治疗当前及新出现的呼吸道病毒，或与直接作用抗病毒药联合使用以增强疗效并减少耐药性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TMPRSS2介导的rHA0切割抑制实验
验证化合物9和10是否能阻断TMPRSS2对流感病毒血凝素前体HA0的切割。
将重组HA0（rHA0）与TMPRSS2在有无化合物的情况下共孵育，通过SDS-PAGE和银染检测未切割的rHA0比例。
假病毒进入抑制实验
验证化合物9和10是否阻断IAV H1N1和SARS-CoV-2 JN.1的进入步骤。
使用编码IAV H1N1或SARS-CoV-2 JN.1表面蛋白的α假病毒（HaPV-luc），处理Calu-3细胞后感染，通过荧光素酶活性检测进入效率。
真病毒感染抑制实验
测定化合物9和10对真实IAV H1N1和SARS-CoV-2 JN.1感染的半数有效浓度（EC50）。
Calu-3细胞预孵育不同浓度化合物后，感染病毒，通过免疫染色检测病毒蛋白，计算EC50。
气液界面（ALI）培养模型中的抗病毒活性
评估化合物9和10在更接近生理条件的人鼻上皮细胞ALI培养模型中对IAV H1N1的抑制效果。
ALI培养物分别预处理化合物后，顶端感染IAV H1N1，48小时后通过免疫荧光检测NS1蛋白表达。
联合用药协同性分析
评估化合物9或10与巴洛沙韦联合使用时对IAV H1N1的抑制作用是否协同。
Calu-3细胞分别用单药或组合处理，进行剂量反应分析，使用SynergyFinder计算协同评分。
小鼠体内攻毒保护实验
评估化合物9和10在小鼠模型中对致死性H1N1感染的保护效果。
BALB/c小鼠经鼻内给予PBS、化合物9或10（7.5 mg/kg），2小时后感染PR8 H1N1，每日给药至感染后4天，监测生存率、体重变化，并于第3天检测肺和鼻甲病毒滴度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
TMPRSS2酶活性测定
蛋白切割抑制实验
病毒进入抑制实验
细胞毒性评估
联合用药分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Eagle最小必需培养基（EMEM） | ATCC | 30-2003™ |
| MucilAir™培养基 | Epithelix Sàrl | EP05MM | |
| Transwell®小室 | Corning | #3470 | |
| 免疫染色 | 甲型流感病毒非结构蛋白1抗体 | GeneTex | GTX125990 |
| 血凝素抗体 | GeneTex | GTX127357 | |
| SARS-CoV-2核衣壳抗体[HL344] | GeneTex | GTX635679 | |
| 山羊抗兔IgG Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| 药物处理 | 巴洛沙韦 | Cedarlane Labs | #35125-50 |
| 卡莫司他 | Tocris | #3193 | |
| 病毒扩增与感染 | 甲型流感病毒H1N1株A/California/07/2009 (H1N1)pdm09 | ATCC | VR-1894™ |
| SARS-CoV-2 JN.1 (NR-59693) | BEI Resources | NR-59693 | |
| 假病毒制备 | α假病毒（荧光素酶） | Virongy Biosciences | -- |
| 酶学分析 | Boc-谷氨酰胺-丙氨酸-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素（Boc-QAR-AMC） | R&D Systems | #ES014 |
| 重组HA0 | Sino Biological | #11055-V08H | |
| 重组HA1 | Sino Biological | #40350-V08H1 | |
| 蛋白纯化 | TALON金属亲和树脂 | Takara Bio | -- |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL柱 | Cytiva | -- | |
| Amicon Ultra离心过滤器 | Millipore | -- | |
| Western blot相关 | Pierce™银染试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | #24612 |
| 显微镜及成像 | CellInsight CX7高内涵筛选系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Leica STELLARIS 5共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| 荧光检测 | SpectraMax Gemini XPS微孔板读板机 | Molecular Devices | -- |
| 动物实验 | BALB/c小鼠 | Charles River Laboratories | -- |
| RNA提取与测序 | RNeasy Protect试剂盒 | Qiagen | cat #74624 |
| NextSeq 2000 P3测序平台 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TMPRSS2酶活性测定 | TMPRSS2浓度、底物Boc-QAR-AMC浓度、化合物浓度范围、孵育时间、KM值 阅读提示：Materials and Methods - Determination of Ki values, Determination of Ki values (slow-binding progression curves) |
| rHA0切割抑制实验 | TMPRSS2浓度、rHA0浓度、化合物浓度、孵育时间、凝胶电泳条件 阅读提示：Materials and Methods - Proteolytic cleavage inhibition assay, Figure 3 |
| 假病毒进入抑制实验 | 细胞密度、化合物浓度、预处理时间、感染时间、假病毒MOI 阅读提示：Materials and Methods - Ha-PV-(luc) entry inhibition assay, Figure 4 |
| 真病毒EC50测定 | 细胞密度、MOI、预处理时间、感染时间、检测抗体 阅读提示：Materials and Methods - Virus infection in Calu-3 cells, Median effective dose (EC50) curves, Figure 5 |
| ALI培养感染实验 | ALI培养物类型、化合物浓度、预处理时间、MOI、感染时间、检测抗体 阅读提示：Materials and Methods - Virus infection in Ali cultures, Figure 6 |
| 联合用药实验 | 化合物浓度组合、感染参数、协同分析软件及模型 阅读提示：Materials and Methods - Statistical analysis, Results - Compounds 9 and 10 work in combination with a direct-acting IAV therapeutic (baloxavir), Figure 7 |
| 小鼠感染实验 | 小鼠品系、年龄、性别、给药剂量、给药途径、给药时间、病毒株和剂量、检测时间点、组织收集 阅读提示：Materials and Methods - Animal model study, Examination of viral burden, Figure 8 |