高通量药物组合筛选
鉴定与ATRi协同的化合物，用于PARPi耐药BRCAm HGSOC治疗。
使用PEO1/OlaR和PEO1/OlaJR细胞系，对2450种组合进行96小时细胞增殖筛选，使用CellTiter-Glo检测存活率，并用ExcessHSA评分评估协同作用。
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AKT1与DHX9相互作用以减轻卵巢癌中R环诱导的复制应激
AKT1 interacts with DHX9 to Mitigate R Loop-Induced Replication Stress in Ovarian Cancer
实验完整度
高包含体外细胞实验（XTT、集落形成、免疫印迹、免疫荧光、彗星实验、DNA纤维实验、DRIP、PLA、Co-IP）和体内异种移植模型（皮下及腹腔），并进行了功能验证和机制研究。
主要模型
PEO1细胞系（BRCA2突变） PEO1/OlaR和PEO1/OlaJR（PARPi耐药） UWB1.289细胞系（BRCA1突变） 皮下和腹腔异种移植NSG小鼠模型
重点核对
ATRi（ceralasertib）和AKTi（capivasertib）的剂量：体外1 μM和10 μM；体内分别为50 mg/kg和130 mg/kg。 PARPi耐药细胞系PEO1/OlaR、PEO1/OlaJR和UWB/OlaR的建立及维持浓度。 AKT1与DHX9相互作用的验证：Co-IP和PLA。 R-loop检测方法：DRIP-qPCR、dot-blot、PLA。
摘要
PARP抑制剂（PARPi）耐药的BRCA突变（BRCAm）高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）是一个新的临床挑战，具有未满足的治疗需求。在此，我们进行了定量高通量药物组合筛选，确定ATR抑制剂（ATRi）和AKT抑制剂（AKTi）的组合是PARPi敏感和PARPi耐药的BRCAm HGSOC的有效治疗策略。ATRi和AKTi联合诱导DNA损伤和R环介导的复制应激（RS）。机制上，AKT1的激酶结构域直接与DHX9相互作用，并促进DHX9招募到R环。AKTi通过减轻DHX9向R环的招募来增加ATRi诱导的R环介导的RS。此外，DHX9在PARPi耐药的BRCAm HGSOC患者的肿瘤中上调，且DHX9和AKT1的高共表达与较差的生存期相关。总之，本研究揭示了AKT1与DHX9之间的相互作用，促进R环的解决，并确定ATRi和AKTi联合作为BRCAm HGSOC的合理治疗策略，无论PARPi耐药状态如何。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何克服PARPi耐药BRCAm HGSOC的治疗难题，并探索ATRi与AKTi联合策略的机制。
- 核心机制
- AKT1通过其激酶结构域直接与DHX9相互作用，促进DHX9招募到R-loop，从而解决R-loop并减轻复制应激；AKT抑制加剧ATRi诱导的R-loop积累和复制应激。
- 主要证据
- 体外细胞实验显示联合治疗增加DNA损伤和R-loop水平，体内异种移植模型显示肿瘤抑制和生存延长；Co-IP、PLA和活细胞成像证实AKT1与DHX9的直接相互作用。
- 研究意义
- 为ATRi和AKTi联合治疗PARPi耐药HGSOC提供了临床开发依据，并可能作为预测联合治疗反应的生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外药效验证
验证ATRi和AKTi联合对细胞增殖、凋亡和DNA损伤的影响。
使用XTT和集落形成实验评估细胞增殖；免疫印迹检测c-PARP；免疫荧光检测γH2AX；碱性彗星实验检测DNA损伤。
机制研究：R-loop和复制应激
探究联合治疗是否通过R-loop积累导致复制应激和DNA损伤。
使用DRIP-qPCR检测R-loop水平；免疫荧光检测pRPA和γH2AX共定位；DNA纤维实验检测复制叉速度；在RNase H1过表达或AKT1敲低/过表达时评估R-loop变化。
AKT1与DHX9的相互作用
证明AKT1与DHX9的直接相互作用及其对DHX9招募到R-loop的影响。
通过Co-IP验证内源性结合；通过PLA检测DHX9-R-loop和AKT1-R-loop相互作用；通过ChIP-qPCR检测DHX9在基因组R-loop区域的富集；通过活细胞成像实时观察。
体内疗效评估
评估ATRi和AKTi联合在体内对肿瘤生长和生存的影响。
使用皮下和腹腔异种移植NSG小鼠模型，注射PEO1或PARPi耐药细胞，治疗4周，监测肿瘤体积、体重和生存期。
临床相关性分析
评估DHX9和AKT1表达与HGSOC患者生存的关系。
使用公共数据库（Kaplan-Meier Plotter）分析卵巢癌患者的DHX9和AKT1表达与PFS的相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
药物筛选
DNA损伤检测
复制应激检测
R-loop检测
生物信息学分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI1640培养基 | Sigma-Aldrich | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 支原体检测试剂盒 | Lonza | LT-07-318 | |
| 药物处理 | 奥拉帕尼 | Selleck Chemicals | S1060 |
| Ceralasertib | Selleck Chemicals | S7693 | |
| Capivasertib | Selleck Chemicals | S8019 | |
| M4344 | MedChemExpress | HY-136270 | |
| M2698 | MedChemExpress | HY-100501 | |
| 细胞凋亡抑制 | Z-VAD-FMK | Promega | G7231 |
| DNA损伤诱导 | 羟基脲 | Sigma-Aldrich | H8627 |
| 药物筛选 | CellTiter-Glo试剂盒 | Promega | G7570 |
| 细胞增殖检测 | XTT检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | X6493 |
| 免疫印迹 | Cleaved PARP抗体 | Cell Signaling Technology | 5625 |
| AKT1抗体 | Cell Signaling Technology | 2938 | |
| 磷酸化S6核糖体蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2211 | |
| 磷酸化CHK1抗体 | Cell Signaling Technology | 2348 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| DHX9抗体 | Bethyl Laboratories | A300-855A | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488标记的磷酸化H2A.X抗体 | BioLegend | 613406 |
| 抗pRPA2 (S4/S8)抗体 | Abcam | ab87277 | |
| DNA纤维实验 | CldU | Sigma-Aldrich | C6891 |
| IdU | Sigma-Aldrich | I7125 | |
| 小鼠抗IdU抗体 | Novus Biological | NBP2-44056 | |
| 大鼠抗CldU抗体 | Novus Biological | NB500-169 | |
| R-loop检测 | S9.6抗体 | Kerafast | ENH001 |
| RNase H | New England BioLabs | M0297L | |
| Hybond N+尼龙膜 | GE Healthcare | RPN303B | |
| Bio-Dot装置 | Bio-Rad | 1706545 | |
| 免疫沉淀 | Protein G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 10003D |
| 染色质免疫沉淀 | Pierce琼脂糖ChIP试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 26156 |
| qPCR | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| iScript Advanced cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | 1725037 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725270 | |
| 转染 | DharmaFECT 1 siRNA转染试剂 | Horizon Discovery | T-2001-01 |
| FuGENE转染试剂 | Promega | E2311 | |
| PLA | Duolink原位红光启动试剂盒 | Sigma-Aldrich | DUO92101 |
| 活细胞成像 | pEGFP-RNASEH1质粒 | Addgene | 108699 |
| pmCherry-Akt1质粒 | Addgene | 86631 | |
| 动物实验 | Matrigel基质胶 | -- | -- |
| Ceralasertib（体内） | AstraZeneca | -- | |
| Capivasertib（体内） | AstraZeneca | -- | |
| Olaparib（体内） | InvivoChem | V300 | |
| 免疫组化 | VECTASTAIN ABC-HRP试剂盒 | LSBio | LS-J1010 |
| ImmPACT DAB底物 | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 苏木素染色液 | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
| Eukitt封片剂 | Electron Microscopy Sciences | 15322 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | PEO1, UWB1.289, OVCAR3, OVCAR8细胞系的培养条件（RPMI1640+10%FBS+0.01mg/mL胰岛素+1%青霉素/链霉素）；PARPi耐药细胞系PEO1/OlaR、PEO1/OlaJR、UWB/OlaR的维持浓度（PEO1/OlaR: 5 μM olaparib; UWB/OlaR和PEO1/OlaJR: 20 μM olaparib）及实验前至少3天撤药。 阅读提示：Materials and Methods - Cell lines |
| 药物处理 | 体外实验中ATRi和AKTi的浓度：XTT实验采用1:10比例（<0.5 μM ceralasertib和<5 μM capivasertib）；机制研究使用1 μM ceralasertib和10 μM capivasertib。体内实验中ceralasertib剂量为50 mg/kg，capivasertib为130 mg/kg。 阅读提示：Materials and Methods - Chemical preparation; Animal study |
| R-loop检测 | DRIP-qPCR方法：S9.6抗体使用浓度（10 μg），RNase H消化作为阴性对照；检测基因包括R-loop阳性CALM3、RPL13A和阴性SNRPN。 阅读提示：Materials and Methods - DNA-RNA immunoprecipitation (DRIP); Figure 2C legend |
| 蛋白相互作用 | Co-IP实验：抗体（AKT1, DHX9）及Protein A/G beads；PLA实验：使用S9.6, DHX9, AKT1抗体，RNase III/T1预处理。 阅读提示：Materials and Methods - Co-immunoprecipitation (co-IP) assay; Proximity ligation assay (PLA) |
| 体内实验 | NSG小鼠的周龄（6周）、性别（雌性）、细胞注射数量（5×10^6）、治疗周期（4周）、给药方案（口服）、分组（vehicle、ceralasertib、capivasertib、联合、olaparib）。 阅读提示：Materials and Methods - Animal study |