PAK4表达和激活分析
评估PAK4在RMS细胞系、患者样本和PDX中的表达水平及激活状态。
利用R2数据集分析PAK4转录水平，免疫组化检测组织芯片，Western blot检测细胞系和肿瘤样本中总PAK4和磷酸化PAK4水平，并检测生长因子刺激后的变化。
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靶向PAK4抑制高危横纹肌肉瘤中Ras介导的信号传导及多种致癌通路
Targeting PAK4 Inhibits Ras-Mediated Signaling and Multiple Oncogenic Pathways in High-Risk Rhabdomyosarcoma
实验完整度
高包含体外细胞实验（增殖、迁移、侵袭、软琼脂克隆）、体内异种移植和转移模型、PDX模型、转录组和蛋白质组分析，以及功能验证和机制验证。
主要模型
RH30细胞系 RD细胞系 TCCC-RMS40患者来源异种移植（PDX）模型 NSG小鼠异种移植模型
重点核对
PAK4敲低或抑制剂处理对细胞增殖、迁移、侵袭和软琼脂集落形成的影响 KPT-9274和PF-3758309在体外对RMS细胞系的IC50值 体内异种移植肿瘤生长和转移灶的形成 PAK4下游信号分子（β-catenin、AKT、PARP）的变化 KPT-9274对PDX模型肿瘤生长的抑制效果
摘要
横纹肌肉瘤（RMS）是儿童中最常见的软组织肉瘤。包括手术、传统化疗和放疗在内的多模式治疗提高了总体生存率。然而，复发或转移性疾病患者的5年生存率低于30%。治疗进展缺乏的原因之一是关键信号节点的识别和靶向。p21激活激酶（PAK）是丝氨酸/苏氨酸激酶家族，位于多种关键致瘤受体酪氨酸激酶（RTK）受体和致癌调节因子（包括IGFR和RAS信号）的下游，显著促进侵袭性恶性表型。在此，我们报道RMS细胞系和肿瘤表现出增强的PAK4表达水平和活性，并进一步被参与RMS发育的生长因子激活。在多个RMS模型中，体外和体内对PAK4的分子干扰导致RMS发展和进展的抑制。融合阳性和融合阴性RMS模型对两种PAK4小分子抑制剂PF-3758309和KPT-9274敏感，这些抑制剂在多个原发和转移性体内模型（包括复发RMS PDX模型）中引发了显著的抗肿瘤和抗转移潜力。对PAK4靶向肿瘤的转录组分析揭示了对RAS-GTPase、Hedgehog和Notch通路的抑制，以及抗肿瘤免疫应答特征的激活证据。这种PAK4靶向基因特征对肉瘤患者具有预后意义。总体而言，我们的结果首次表明PAK4是治疗高危RMS的新型且可行的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PAK4在横纹肌肉瘤（RMS）中的表达和功能作用，以及靶向PAK4是否是一种可行的治疗策略。
- 核心机制
- PAK4通过调节RAS-GTPase、Hedgehog、Notch等信号通路和细胞周期、转移相关蛋白，促进RMS肿瘤发生和进展。
- 主要证据
- 体外细胞实验、体内异种移植和转移模型、PDX模型以及转录组和蛋白质组分析证明PAK4高表达，敲低或药理学抑制可抑制肿瘤生长和转移，并诱导凋亡。
- 研究意义
- PAK4是治疗高危RMS的新型可行靶点，其抑制剂的抗肿瘤效果为临床转化提供了依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PAK4敲低和过表达的功能研究
通过分子干扰（敲低和过表达）验证PAK4对RMS细胞肿瘤和转移表型的影响。
使用shRNA敲低PAK4，并过表达PAK4，检测细胞活力、迁移、侵袭和锚定非依赖性生长（软琼脂集落形成）。
PAK4敲低的体内肿瘤生长和转移评估
评估PAK4敲低对体内肿瘤生长和转移的影响。
将shPAK4或对照的RH30和RD细胞注射到NSG小鼠的腓肠肌（原位模型）或尾静脉（转移模型），监测肿瘤体积和转移灶形成。
PAK4小分子抑制剂的体外效果评价
评估PAK4小分子抑制剂KPT-9274和PF-3758309对RMS细胞增殖、凋亡、细胞周期和迁移侵袭的影响。
使用不同浓度的抑制剂处理RMS细胞，检测细胞活力（IC50）、凋亡（流式）、细胞周期（PI染色）、迁移侵袭（Boyden小室），并检测信号通路蛋白的变化。
PAK4抑制剂的体内治疗效果评估
评估PAK4抑制剂在体内对肿瘤生长和转移的抑制作用。
在NSG小鼠原位或尾静脉模型中，给予KPT-9274（灌胃）或PF-3758309（皮下注射），监测肿瘤体积和转移灶。
转录组和蛋白质组分析
阐明PAK4抑制后的分子机制。
对KPT-9274处理的肿瘤进行RNA-seq和RPPA分析，鉴定差异表达基因和蛋白，并进行通路富集分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | KPT-9274 | Karyopharm Therapeutics | -- |
| PF-3758309 | MedChemExpress | HY-13007 | |
| 细胞凋亡检测 | 死细胞凋亡检测试剂盒 | ThermoFisher | V13242 |
| 细胞增殖检测 | BrdU细胞增殖试剂盒 | Cell Signaling Technology | 6813 |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo Laboratories | -- |
| CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂 | Promega | -- | |
| 蛋白质印迹 | PAK4抗体 | ProteinTech | 14685-1-AP |
| HIF-1α抗体 | Novus Biological | -- | |
| β-肌动蛋白抗体（克隆C4） | Millipore | -- | |
| AXL (Tyr702)抗体 (D12B2) | Cell Signaling | -- | |
| β-连环蛋白抗体 | Cell Signaling | 9582 | |
| S675磷酸化β-连环蛋白抗体 | Cell Signaling | 4176 | |
| S474磷酸化PAK4抗体 | Cell Signaling | 3241 | |
| 纽蛋白抗体 | Cell Signaling | 13901 | |
| 细胞培养 | RPMI培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 支原体检测 | MycoAlert支原体检测试剂盒 | Lonza | -- |
| 流式分析 | 碘化丙啶流式细胞术细胞试剂盒 | Abcam | ab139418 |
| BD LSRII分析仪 | BD | -- | |
| 蛋白质印迹 | ECL化学发光试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| LiCor-Odyssey系统 | Li-Cor | -- | |
| RNA提取和qPCR | Trizol试剂 | -- | -- |
| qScript cDNA合成预混液 | QuantaBio | -- | |
| iTaq通用SYBR Green预混液 | Bio-Rad | -- | |
| StepOnePlus实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| RNA测序 | Tapestation 4200系统 | Agilent | -- |
| Qubit荧光计 | Thermo Fisher | -- | |
| QIAseq链特异性总RNA文库制备试剂盒 | Qiagen | -- | |
| NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- | |
| 免疫组织化学 | VECTASTAIN Elite ABC试剂盒 | Vector Laboratories | -- |
| 组织芯片 | 组织芯片玻片 (SO751) | US Biomax | SO751 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和基因操作 | 细胞系来源（COG）、培养基（RPMI+20%FBS）、转染试剂（Lipofectamine 3000/RNAiMAX）、siRNA浓度（10nM）、稳定克隆筛选（嘌呤霉素） 阅读提示：Materials and Methods - Cell lines, cell culture and stable cell generation |
| 体外功能实验 | 迁移/侵袭实验的细胞数、趋化因子（10% FBS）、时间（24h）、基质胶浓度（30μg/ml）；软琼脂集落形成实验的细胞密度（20-50万/孔）、琼脂糖浓度（0.5%底层和0.35%顶层）、培养时间（14-21天） 阅读提示：Materials and Methods - Migration and Invasion Assay, Soft Agar Colony Formation Assay |
| 药物处理 | KPT-9274和PF-3758309的浓度（IC50范围）、处理时间（72小时） 阅读提示：Results - Pharmacological inhibition of PAK4 leads to regression of tumorigenic properties in vitro |
| 体内模型 | 小鼠品系（NSG）、细胞注射数量（原位0.5x10^6）、给药方式（KPT-9274灌胃，PF-3758309皮下）、给药频率（每日两次，每周5天）、给药起始时间（肿瘤可触及后） 阅读提示：Materials and Methods - In Vivo Xenograft Assay; Results - Pharmacologic inhibition of PAK4 leads to regression of tumor growth and metastatic progression |
| 转录组分析 | RNA-seq文库制备（QIAseq试剂盒）、测序平台（NextSeq 500）、差异表达基因阈值（|fold change|>=1.25, p<0.05）、通路富集（GSEA） 阅读提示：Materials and Methods - RNA-Sequencing Library Preparation and Sequencing, Total RNA-Seq analysis; Results - PAK4 inhibition leads to attenuation of molecular signatures involved in cell cycle and metastatic progression |