体外验证示踪剂特异性
验证[18F]AlF-FAPI-74对FAP的特异性结合。
将I45野生型（WT）和人FAP转导细胞（huFAP）与示踪剂共孵育，并加入未标记FAPI进行竞争阻断，测量细胞摄取。
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使用[18F]AlF-FAPI-74监测抗FAP CAR T细胞疗法的治疗反应
Monitoring Therapeutic Response to Anti-FAP CAR T Cells Using [18F]AlF-FAPI-74
实验完整度
高包含体外细胞摄取、细胞毒性、PET成像、离体生物分布和免疫荧光等多层级验证，并设有竞争阻断及FAP敲除对照，功能与机制验证完整。
主要模型
I45人间皮瘤细胞系（野生型及人FAP转导） A549人肺腺癌细胞系 NSG小鼠皮下异种移植瘤模型
重点核对
[18F]AlF-FAPI-74对FAP的特异性验证（包括体外竞争阻断和FAP敲除小鼠模型） FAP CAR T细胞的体外杀伤活性及IFNγ释放 CAR T细胞注射剂量（5×106 CAR+ T细胞）及时间（治疗后14天成像） PET信号与离体生物分布及免疫荧光染色的相关性
摘要
目的：尽管嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在血液恶性肿瘤治疗中取得成功，但针对实体瘤的CAR T细胞疗法因缺乏持久反应和毒性报告而受到限制。定量工具能够表征肿瘤中CAR T靶向抗原并准确监测反应，可能有助于我们理解实体瘤疗效有限的原因。设计：我们使用放射性标记的成纤维细胞激活蛋白（FAP）抑制剂（FAPI）[18F]AlF-FAPI-74探针，以补充正在进行的FAP CAR T细胞的开发与优化工作。我们在体外表征了该放射性示踪剂对FAP的选择性，并利用肺癌啮齿动物模型评估了其监测FAP表达变化的能力。结果：[18F]AlF-FAPI-74在体外对FAP+细胞具有选择性滞留，在未标记FAPI存在时，其摄取被有效阻断。在体内，[18F]AlF-FAPI-74能够以高靶本比检测肿瘤细胞以及肿瘤微环境中FAP+基质细胞上的FAP表达。我们进一步证明了该示踪剂在FAP CAR T细胞治疗后监测FAP表达变化的效用，且PET成像结果与离体分析显示出强相关性。结论：这种无创成像方法用于探查肿瘤微环境，代表了诊断性PET探针与实体瘤CAR T细胞疗法的创新结合，并有潜力作为FAP及其他基质靶向疗法的预测性和药效学反应生物标志物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 评估[18F]AlF-FAPI-74 PET成像能否预测和监测FAP CAR T细胞治疗实体瘤的反应。
- 核心机制
- FAP CAR T细胞靶向并清除肿瘤微环境中表达FAP的细胞（包括CAFs），导致PET信号降低。
- 主要证据
- 在A549肿瘤模型中，FAP CAR T细胞治疗后肿瘤体积显著减小，PET肿瘤/肌肉比下降2-3倍，离体生物分布显示FAP CAR治疗组肿瘤摄取降低3.5倍，免疫荧光证实CAFs被清除。
- 研究意义
- 该成像方法可作为FAP及基质靶向疗法的预测性和药效学生物标志物，有助于患者选择和反应监测。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内成像FAP表达
评估示踪剂在体内检测肿瘤细胞及基质FAP表达的能力。
在NSG小鼠皮下分别建立I45（WT和huFAP）及A549肿瘤模型，注射示踪剂后进行PET/CT成像，并通过离体生物分布和免疫荧光验证。
体外验证CAR T细胞功能
验证FAP CAR T细胞的靶向杀伤能力和特异性活化。
将FAP CAR T细胞与I45 WT和huFAP靶细胞共培养，检测细胞毒性（MTS）和IFNγ释放（ELISA）。
体内监测治疗反应
评估[18F]AlF-FAPI-74 PET能否监测FAP CAR T细胞的治疗效果。
A549荷瘤小鼠注射FAP CAR T细胞或非转导对照T细胞，在基线和治疗后第14天进行PET成像，并测量肿瘤体积。
离体验证成像结果
验证PET成像变化是否反映肿瘤FAP表达的真实改变。
对治疗后肿瘤进行离体生物分布分析、流式细胞术（CD45+细胞百分比）和免疫荧光染色（FAP、αSMA、PDGFRα）。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证免疫效应
验证机制链路
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞摄取研究 | [18F]AlF-FAPI-74 | -- | -- |
| FAPI-74 | ABX advanced biochemical compounds gmbH | -- | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| Versene | ThermoFisher Scientific | -- | |
| PCR Mycoplasma检测 | PCR试剂盒 | Sigma Aldrich | 200-664-3 |
| 体外摄取研究 | 磷酸盐缓冲液 | Corning | 21-031-CM |
| 放射性计数 | 伽马计数器 | PerkinElmer | -- |
| 4G5抗体生产 | 快速ELISA小鼠单克隆抗体分型试剂盒 | ThermoFisher | 37503 |
| CAR构建 | Takara逆转录试剂盒 | Takara | RR057A |
| 小鼠可变链引物 | Progen | F2010 | |
| 5' RACE试剂盒 | Invitrogen | 18374058 | |
| CAR T细胞生成 | Dynabeads™磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 11131D |
| 流式细胞术 | 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A9418 |
| Alexa Fluor® 647标记F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-606-072 | |
| LSR II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 细胞毒性实验 | IFNγ ELISA试剂盒 | Abcam | ab174443 |
| CellTiter 96®非放射性细胞增殖检测试剂盒（MTS） | Promega | G5421 | |
| 肿瘤模型 | NSG小鼠 | -- | RRID:BCBC_4142 |
| 小动物PET/CT | 小动物PET/CT | Molecubes | -- |
| 图像分析 | MIM软件 | MIM Software | -- |
| 离体生物分布 | BD Horizon™干燥肿瘤和组织解离试剂 | BD Biosciences | 661563 |
| 70μm尼龙网细胞过滤器 | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 流式细胞术 | PE-Dazzle 594偶联抗人CD45抗体 | BioLegend | 344744 |
| 免疫荧光 | OCT包埋剂 | -- | -- |
| 冷冻切片机（Leica CM 1950） | Leica | -- | |
| 玻璃载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 牛血清白蛋白（Rockland） | Rockland | BSA-50 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 10789704001 | |
| 兔单克隆抗FAP α抗体 | Abcam | ab207178 | |
| 山羊多克隆抗血小板衍生生长因子受体α抗体 | R&D Systems | AF1062 | |
| FITC偶联小鼠抗小鼠/人α-平滑肌肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | F3777 | |
| Alexa 555驴抗兔IgG | Thermo Fisher Scientific | A32794 | |
| DyLight 650驴抗山羊IgG | Thermo Fisher Scientific | 84545 | |
| ProLong™ Diamond抗淬灭封片剂（含DAPI） | ThermoFisher | P36971 | |
| Nikon NIS-Elements显微镜 | Nikon | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外细胞摄取 | 细胞系（I45 WT/huFAP）、细胞数（1×10^6）、示踪剂剂量（~90-100μCi）、孵育时间（1小时）、竞争物浓度（10μM未标记FAPI） 阅读提示：Materials and Methods: In Vitro Cell Uptake Study |
| 肿瘤模型 | 细胞系（I45、A549）、植入细胞数（1×10^6）、生长时间（I45：2周；A549：3周）、肿瘤体积（~100mm^3）、小鼠品系（NSG） 阅读提示：Materials and Methods: Tumor Model |
| PET成像 | 示踪剂剂量（~200-250μCi）、成像时间（注射后1小时）、麻醉（2%异氟烷） 阅读提示：Materials and Methods: Tumor Model & Small Animal PET Imaging |
| CAR T细胞治疗 | T细胞剂量（5×10^6 CAR+或NTD）、给药途径（静脉）、成像时间点（基线、第14天） 阅读提示：Materials and Methods: Tumor Model & Small Animal PET Imaging; Results: Figure 5 |
| 离体生物分布 | 组织收获时间（终末成像后）、γ计数器（PerkinElmer）、%ID/g计算 阅读提示：Materials and Methods: Ex Vivo Biodistribution |
| 免疫荧光 | 一抗（anti-FAP, anti-PDGFRα, anti-αSMA）、二抗、DAPI封片剂 阅读提示：Materials and Methods: Immunofluorescence Staining |