建立IGO和OGO移植模型
建立可模拟PDAC进展的体内模型，并比较两种模型的差异。
将患者来源类器官注射到免疫缺陷小鼠的胰腺导管内（IGO）或胰腺间质中（OGO），观察肿瘤形成和进展。
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人类胰腺导管腺癌的导管内移植模型揭示分子亚型的渐进性转化
Intraductal Transplantation Models of Human Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Reveal Progressive Transition of Molecular Subtypes
实验完整度
高包含体外类器官培养、体内IGO和OGO移植模型、RNA-seq转录组分析、LCM、KRAS基因剂量操纵及患者数据验证等多个独立证据层级。
主要模型
患者来源PDAC类器官的IGO移植模型 患者来源PDAC类器官的OGO移植模型 NSG小鼠
重点核对
IGO移植使用50,000-100,000个细胞，悬浮于25μl PBS中 OGO移植使用50,000个细胞，悬浮于50μl Matrigel中 KRAS过度激活通过4-OHT（0.1μM）处理48小时或他莫昔芬（1mg/kg）灌胃5天 使用Autobow系统进行谱系追踪 使用FACETS分析KRAS拷贝数
摘要
胰腺导管腺癌(PDAC)是最常见的致命恶性肿瘤，过去几十年来患者预后几乎没有改善。最近，具有不同预后的胰腺癌亚型已被阐明，然而无法模拟这些亚型阻碍了对其起源的机制性研究。在此，我们提出一种PDAC的异种移植模型，其中肿瘤来源于直接注射到小鼠胰腺导管内的患者来源类器官。我们的模型能够区分两种主要的PDAC亚型：来自该模型的导管内肿瘤以惰性或侵袭性方式进展，分别代表PDAC的经典型或基底样型。影响该导管内模型中PDAC亚型指定的参数包括细胞可塑性和Ras通路的过度激活。最后，通过瘤内解剖和直接操纵RAS基因剂量，我们鉴定了一组RAS调节的分泌和膜结合蛋白，它们可能代表PDAC患者治疗干预的潜在候选靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何建立能够模拟PDAC分子亚型（基底样和经典型）的体内模型，并探究亚型转化的机制？
- 核心机制
- 细胞可塑性和RAS通路过度激活促进基底样表型的转化。
- 主要证据
- 通过IGO模型，发现Fast-progressors呈现基底样表型且KRAS拷贝数较高；KRAS过度激活可诱导慢进展类器官产生基底样特征和侵袭性表型。
- 研究意义
- 为PDAC亚型研究提供了新的工具，可能有助于发现早期检测生物标志物和治疗干预靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
生存期分析及Fast/Slow-progressor分类
根据生存时间的不同将类器官分为快进展型和慢进展型。
对21种类器官进行IGO和OGO移植，记录生存时间，使用双峰分布确定阈值。
转录组分析比较IGO和OGO肿瘤
探讨移植微环境对肿瘤细胞和基质细胞转录组的影响。
对IGO和OGO肿瘤进行RNA-seq，使用GSEA分析通路富集，比较亚型特征。
细胞可塑性验证
验证亚型转化是否由细胞可塑性而非克隆选择驱动。
使用Autobow系统标记器官oid，进行谱系追踪，观察单克隆是否产生不同亚型的病变。
KRAS功能验证
探究KRAS过度激活是否足以诱导基底样表型和侵袭性。
在慢进展类器官中诱导KRAS过度激活（体外4-OHT处理，体内他莫昔芬处理），检测表型变化和基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | NSG小鼠 | Jackson Laboratories | -- |
| 微血管夹（S&T血管夹00396-01） | F.S.T | 00396-01 | |
| 汉密尔顿注射器（80508） | HAMILTON | 80508 | |
| 6-0丝线缝合线 | CP Medical Sutures | -- | |
| VETCLOSE手术胶 | Henry Schein | CA1999 | |
| 徕卡LMD7000系统 | Leica | -- | |
| 基质胶 | BD | -- | |
| 他莫昔芬 | -- | -- | |
| 细胞分离 | 胶原酶D | Sigma-Aldrich | -- |
| Liberase DL | Sigma-Aldrich | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | -- | |
| ACK裂解缓冲液 | Gibco | -- | |
| 人EpCam包被磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-061-101 | |
| 质粒构建与转染 | pBOBI-PGK-puro-EF1-LS质粒 | -- | -- |
| p-lenti-PGK-ER-KRASG12V质粒 | Addgene | 35635 | |
| pCAG-Autobow质粒 | Addgene | 45182 | |
| Xtremegene9转染试剂 | Roche | -- | |
| 遗传霉素 | Life Technologies | -- | |
| 细胞培养 | 生长因子减少的基质胶 | Corning | -- |
| 人完全培养基（hCPLT） | -- | -- | |
| 支原体检测试剂盒 | Lonza | LT07-318 | |
| 病毒包装 | Lenti-X浓缩液 | Clontech | -- |
| 药物处理 | 4-羟基他莫昔芬（4-OHT） | Sigma-Aldrich | -- |
| 增殖实验 | CellTiter-Glo试剂 | Promega | G7573 |
| 组织学 | ImmPACT DAB显色液 | Vector | -- |
| ImmPRESS-AP试剂盒 | Vector | -- | |
| Cytoseal 60封片剂 | -- | -- | |
| Axio Imager.A2显微镜 | ZEISS | -- | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| Prolong Gold抗淬灭封片剂 | Invitrogen | P10144 | |
| 徕卡TCS SP8激光扫描共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| p-ERK抗体（4370） | Cell Signaling | 4370 | |
| TP63抗体（39692） | Cell Signaling | 39692 | |
| S100A2抗体（ab109484） | abcam | ab109484 | |
| GATA6抗体（AF1700-SP） | R&D | AF1700-SP | |
| AGR2抗体（13062） | Cell Signaling | 13062 | |
| αSMA抗体（M0851） | Dako | M0851 | |
| 人线粒体抗体（MAB1273） | Millipore | MAB1273 | |
| CK19抗体（TROMA III） | DSHB | TROMA III | |
| Ki67抗体（RM-9106） | Thermo | RM-9106 | |
| 波形蛋白抗体（5741） | Cell Signaling | 5741 | |
| GFP抗体（ab13970） | abcam | ab13970 | |
| YFP抗体（EVN-AB606-C200） | Axxora | EVN-AB606-C200 | |
| RFP抗体（EMU107） | Kerefast | EMU107 | |
| F-actin抗体（A12379） | Invitrogen | A12379 | |
| 抗小鼠Alexa Fluor 488二抗（A21202） | Thermo Fisher Scientific | A21202 | |
| 抗兔Alexa Fluor 647二抗（A21244） | Thermo Fisher Scientific | A21244 | |
| 抗大鼠Alexa Fluor 568二抗（A11077） | Thermo Fisher Scientific | A11077 | |
| 抗鸡Alexa Fluor 488二抗（A11039） | Thermo Fisher Scientific | A11039 | |
| 抗兔Alexa Fluor 546二抗（A11035） | Thermo Fisher Scientific | A11035 | |
| 抗豚鼠Alexa Fluor 647二抗（A21450） | Thermo Fisher Scientific | A21450 | |
| DAB显色液（SK-4105） | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 红色碱性磷酸酶底物（SK-5105） | Vector Laboratories | SK-5105 | |
| 全组织免疫荧光 | 8孔腔室玻片 | Ibidi | 80826 |
| 三维免疫荧光 | 硼酸 | Sigma-Aldrich | -- |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 组织透明化试剂盒 | Abcam | ab243298 | |
| 图像采集与分析 | Aperio CS2扫描仪 | Leica | -- |
| ImageJ软件 | -- | -- | |
| 蛋白提取与免疫印迹 | 细胞回收液 | Corning | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11836170001 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Roche | 4906845001 | |
| 4-12% Bis-Tris NuPAGE凝胶 | Life Technologies | -- | |
| MOPS电泳缓冲液 | Life Technologies | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| ECL底物 | GE Healthcare | -- | |
| TP63抗体（39692） | Cell Signaling | 39692 | |
| S100A2抗体（ab109484） | abcam | ab109484 | |
| GATA6抗体（AF1700-SP） | R&D | AF1700-SP | |
| HSP90α抗体（07-2174） | EMD Millipore | 07-2174 | |
| SMAD4抗体（sc-7966） | Santa Cruz | sc-7966 | |
| p-ERK1/2抗体（4370） | Cell Signaling | 4370 | |
| ERK1/2抗体（4695） | Cell Signaling | 4695 | |
| DNA提取 | DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | -- |
| Covaris聚焦声波系统 | Covaris | -- | |
| NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒 | NEB | -- | |
| BioAnalyzer（Agilent 2100） | Agilent | 2100 | |
| Illumina NextSeq平台 | Illumina | -- | |
| LCM | PEN膜玻璃载玻片 | -- | -- |
| Arcturus PicoPure DNA提取试剂盒 | Thermo | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596-018 |
| PureLink RNA小提试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| RT-qPCR | TaqMan反转录试剂 | Applied Biosystems | N808-0234 |
| Taqman通用预混液II（无UNG） | ThermoFisher Scientific | -- | |
| QuantStudio 6-Flex实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| RNA-seq | TruSeq链式总RNA试剂盒（含RiboZero人/小鼠/大鼠） | Illumina | RS-122-2202 |
| NucleoSpin FFPE XS总RNA提取试剂盒 | Clontech | -- | |
| SMARTer链式总RNA-seq试剂盒v2（Pico输入哺乳动物） | Takara | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| IGO移植 | 细胞数量（50,000-100,000个）、悬浮体积（25μl PBS）、注射位置（胰管）、小鼠品系（NSG）、麻醉（2.5-3%异氟烷） 阅读提示：Methods: Animal Experiments |
| OGO移植 | 细胞数量（50,000个）、Matrigel与PBS比例（1:1）、注射位置（胰腺尾部）、小鼠品系（NSG） 阅读提示：Methods: Animal Experiments |
| KRAS诱导 | 4-OHT浓度（0.1μM）、处理时间（48小时）、他莫昔芬剂量（1mg/kg）、给药方式（口服灌胃）、给药方案（连续5天，持续4周） 阅读提示：Methods: Animal Experiments, Organoid Culture and 4-OHT Treatment |
| 亚型分类 | 生存时间阈值（Fast<111天，Slow>157天）、分类方法（双峰分布拟合） 阅读提示：Methods: Classification of Fast and Slow-progressors |
| LCM | 切片染色（H&E、S100A2）、切割区域（导管内 vs 侵袭性）、DNA/RNA提取方法 阅读提示：Methods: Genomic DNA Isolation from FFPE sections, RNA-Seq of LCM IGO Tumors |