细胞实验验证ISS检测碱基编辑和先导编辑
验证ISS能否准确检测培养细胞中的碱基编辑和先导编辑事件
利用HEK293T GFP报告细胞系，通过转染碱基编辑器或先导编辑器，引起GFP基因修复；随后进行ISS，使用padlock探针特异性识别编辑序列，并通过滚环扩增和测序检测编辑事件。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
小鼠和猕猴体内基因编辑的空间分析：基于原位测序
Spatial profiling of gene editing by in situ sequencing in mice and macaques
实验完整度
高该研究包含多个独立的证据层级：体外细胞实验、小鼠脑和肝脏体内实验、非人灵长类动物实验，并包含功能验证（如编辑率与GFP表达一致性）和机制验证（如区域化编辑分析）。
主要模型
HEK293T GFP报告细胞系 小鼠脑组织（皮质、小脑、下丘脑） 小鼠肝脏 食蟹猴肝脏
重点核对
细胞实验中GFP阳性细胞比例与ISS检测的编辑率一致性 脑组织中NGS与ISS检测的编辑率相关性 RNA-LNP递送后肝脏各代谢区编辑效率的均一性 重复给药时初次剂量对后续剂量编辑效率的影响
摘要
碱基编辑和先导编辑技术能够在分裂和非分裂细胞中精确安装特定的核苷酸编辑，为直接在生物体中纠正致病突变提供了潜力。然而，为了充分利用其治疗潜力，以高空间分辨率准确测量编辑率至关重要。在这里，我们采用基于成像的原位测序（ISS）来绘制天然组织内的碱基编辑和先导编辑事件。我们在经intein-split腺嘌呤碱基编辑器或先导编辑器处理的、并通过腺相关病毒（AAV）载体递送的小鼠大脑中建立并验证了该技术。接下来，我们将ISS应用于经编码ABE的脂质纳米颗粒包裹的mRNA和引导RNA（RNA-LNP）处理的小鼠和猕猴肝脏。在所有代谢区的肝小叶中均观察到有效编辑。此外，在重复给药RNA-LNP的实验中，初始剂量不影响后续剂量的编辑效率和分布。我们的研究结果表明，ISS能够可视化体内基因编辑事件，并提示使用RNA-LNP递送碱基编辑器可用于治疗多种代谢性肝脏疾病。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何在高空间分辨率下准确测量体内基因编辑事件，并评估不同递送载体（AAV和RNA-LNP）在脑和肝脏等组织中的编辑效果？
- 核心机制
- ISS通过逆转录mRNA、连接padlock探针和滚环扩增，以单细胞分辨率直接检测编辑位点，揭示了编辑在组织中的空间分布和单细胞水平的编辑模式（如纯合/杂合编辑比例）。
- 主要证据
- 在培养细胞中验证了ISS识别碱基编辑和先导编辑的能力；在小鼠脑和肝脏中，ISS检测的编辑率与NGS结果一致；在猕猴肝脏中，RNA-LNP递送后所有代谢区均观察到有效编辑，且重复给药不影响编辑效率。
- 研究意义
- ISS为体内基因编辑的空间分辨分析提供了有力工具，可用于临床前优化和临床转化评估；RNA-LNP递送碱基编辑器可能适用于治疗多种代谢性肝脏疾病。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠脑内AAV递送后的碱基编辑和先导编辑检测
评估ISS能否在脑组织中可视化碱基编辑和先导编辑，并分析不同细胞类型的编辑率
通过ICV注射将编码intein-split碱基编辑器或先导编辑器的AAV-PHP.eB载体递送至新生小鼠脑内，6周后取脑组织，利用ISS和NGS检测编辑率，并用NeuN和GFAP染色区分神经元和星形胶质细胞。
小鼠肝脏内AAV和RNA-LNP递送后的碱基编辑空间分析
比较AAV和RNA-LNP递送碱基编辑器在小鼠肝脏各代谢区的编辑效率
分别通过尾静脉注射AAV8/AAV9或RNA-LNP编码的ABE，1周或6周后取肝组织，利用ISS结合Ecad、GS等染色划分肝小叶代谢区，分析各区的编辑率。
非人灵长类猕猴肝脏RNA-LNP递送后的碱基编辑空间分析
评估RNA-LNP递送碱基编辑器在大型动物肝脏中的空间编辑模式及重复给药的影响
对食蟹猴分两次静脉输注RNA-LNP，分别靶向ACTB基因的两个位点，1周后取肝组织，利用ISS结合ASS1和GS染色划分代谢区，分析编辑率和细胞水平编辑模式。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM添加GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| OptiMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 胰蛋白酶替代物 | Gibco | -- | |
| 博来霉素 | -- | -- | |
| AAV生产 | 碘克沙醇 | Sigma-Aldrich | -- |
| Vivaspin 20离心浓缩管 | VWR | -- | |
| Qubit 3.0荧光计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| mRNA生产 | m1Ψ-5'-三磷酸 | TriLink | -- |
| CleanCap加帽类似物 | TriLink | -- | |
| 纤维素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| LNP制备 | Quant-iT Ribogreen检测试剂盒 | Life Technologies | -- |
| 马尔文粒度仪 | Malvern Panalytical | -- | |
| 动物实验 | Hamilton微量注射器 | Hamilton | -- |
| 免疫组织化学 | 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | Sigma-Aldrich | -- |
| Prolong Gold抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 原位测序 | RevertAid H Minus M-MuLV逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RiboLock RNA酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Ampligase连接酶 | Lucigen | -- | |
| ϕ29 DNA聚合酶 | NEB | -- | |
| Illumina MiSeq Nano测序试剂盒 | Illumina | MS-103-1001 | |
| 图像采集 | 蔡司倒置荧光显微镜 | Zeiss | -- |
| 组织切片 | 冷冻切片机 | LEICA | -- |
| Superfrost载玻片 | Epredia | -- | |
| 激光显微切割 | ArcturusXT激光捕获显微切割系统 | Thermo Scientific | -- |
| Arcturus CapSure Macro LCM捕获盖 | Life Technologies | -- | |
| 分子克隆 | T4 DNA连接酶 | NEB | -- |
| HiFi DNA组装预混液 | NEB | -- | |
| Q5高保真DNA聚合酶 | NEB | -- | |
| PCR | NEBNext高保真2xPCR预混液 | NEB | -- |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| 测序 | Illumina Miseq测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞实验 | 细胞系类型（HEK293T）、转染试剂和剂量（Lipofectamine 2000）、质粒浓度和比例、培养时间 阅读提示：Methods: Cell culture maintenance and transfection |
| 动物实验 | 小鼠品系和年龄、注射剂量（AAV滴度、LNP剂量）、注射途径（尾静脉、ICV）、取材时间 阅读提示：Methods: Animal studies |
| 原位测序 | 组织固定和透化条件、探针设计（序列和浓度）、逆转录和连接条件、滚环扩增时间 阅读提示：Methods: Padlock-based RNA detection, In situ sequencing |
| 图像分析 | 图像分割参数（CellProfiler）、RCP识别阈值、read质量阈值、最小read数 阅读提示：Methods: Image analysis, Data processing and statistical analysis |