谷氨酸可以作为小鼠植入前胚胎的信号分子

Glutamate can act as a signaling molecule in mouse preimplantation embryos†

作者信息Alexandra Špirková, Veronika Kovaříková, Zuzana Šefčíková, Jozef Pisko, Martina Kšiňanová, Juraj Koppel, Dušan Fabian, Štefan Čikoš
PMID35746896
发布时间2022-10-11
DOI10.1093/biolre/ioac126

实验完整度

基因表达(RT-PCR)、蛋白表达(免疫荧光)、功能实验(激动剂/拮抗剂)及体内模型,覆盖分子-细胞-胚胎多个层级。

主要模型

小鼠排卵卵母细胞 小鼠体内发育囊胚

重点核对

谷氨酸处理方法:L-谷氨酸(Sigma-Aldrich)浓度2、5、10mM,培养24h 激动剂处理:AMPA、海人藻酸、NMDA、DHPG、LY379268、L-AP4的浓度和孵育时间 拮抗剂预处理:CNQX和MPEP浓度(300μM和10μM)及预处理20min 囊胚分组样本量:如对照n=44,GlAc2mM n=51等 统计方法:单因素方差分析和Tukey检验,P<0.05为显著

摘要

游离氨基酸存在于植入前胚胎的自然环境中,其可用性可影响早期胚胎发育。谷氨酸是雌性生殖液中浓度最高的氨基酸之一,我们研究了谷氨酸/谷氨酸盐是否可以通过细胞膜受体影响植入前胚胎发育。使用逆转录聚合酶链反应,我们在小鼠排卵卵母细胞和/或体内发育的囊胚中检测到15种离子型谷氨酸受体转录本和8种代谢型谷氨酸受体转录本。使用免疫组织化学,我们在囊胚中检测到两种α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体亚基、三种海人藻酸受体亚基和第5号代谢型谷氨酸受体蛋白的表达。细胞外谷氨酸浓度从5 mM开始损害小鼠囊胚发育,这一事实可能具有重要的实际意义,因为谷氨酸及其盐类(主要是谷氨酸钠)广泛用作食品添加剂。使用谷氨酸受体激动剂(结合基因表达分析)的实验表明,特定的AMPA受体(由谷氨酸受体、离子型、AMPA3 [GRIA3]和/或谷氨酸受体、离子型、AMPA4 [GRIA4]亚基组成)、海人藻酸受体(由谷氨酸受体、离子型、海人藻酸3 [GRIK3]和谷氨酸受体、离子型、海人藻酸4 [GRIK4]或谷氨酸受体、离子型、海人藻酸5 [GRIK5]亚基组成)和第5号代谢型谷氨酸受体(GRM5)参与了这一效应。用AMPA、海人藻酸和GRM5受体拮抗剂预处理囊胚,可阻止或减少谷氨酸诱导的效应,进一步证实了这些受体类型的参与。我们的结果表明,谷氨酸可以作为植入前胚胎中的信号分子,通过激活细胞膜受体发挥其作用。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
谷氨酸/谷氨酸盐能否通过细胞膜受体影响小鼠植入前胚胎的发育?
核心机制
谷氨酸通过激活AMPA受体(GRIA3/GRIA4)、海人藻酸受体(GRIK3/GRIK4/GRIK5)和代谢型受体GRM5,损害囊胚发育,增加细胞死亡。
主要证据
RT-PCR检测到受体mRNA,免疫荧光检测到受体蛋白,功能实验中5mM谷氨酸及激动剂降低细胞数、增加死亡细胞,拮抗剂CNQX和MPEP阻断这些效应。
研究意义
谷氨酸不仅是营养因子,还可作为细胞外信号分子影响早期胚胎发育,提示食品添加剂谷氨酸盐可能对胚胎发育有潜在影响。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

谷氨酸受体表达分析

确定小鼠卵母细胞和囊胚中谷氨酸受体的表达谱。

通过RT-PCR分析15种离子型和8种代谢型谷氨酸受体转录本,并通过免疫荧光检测GRIA3、GRIA4、GRIK3、GRIK4、GRIK5和GRM5蛋白表达。

2

谷氨酸对囊胚发育的影响

检测细胞外谷氨酸浓度升高是否影响囊胚发育。

将囊胚培养于含L-谷氨酸(2,5,10mM)的KSOM培养基24h,评估细胞数和死亡细胞比例。

3

谷氨酸受体激动剂的作用验证

确定哪些受体亚型参与介导谷氨酸的作用。

使用AMPA、海人藻酸、NMDA、DHPG、LY379268、L-AP4刺激囊胚,观察发育指标。

4

拮抗剂阻断谷氨酸效应

验证AMPA/海人藻酸和GRM5受体是谷氨酸效应所必需。

先用CNQX和MPEP预处理囊胚20min,再加入5mM L-谷氨酸培养24h,评估发育指标。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
EmbryoMax KSOM培养基MilliporeMR-020P
L-谷氨酸Sigma-Aldrich--
NMDAAbcamab120052
AMPAAbcamab120005
海人藻酸Abcamab120100
(S)-3,5-二羟基苯甘氨酸Abcamab120007
LY 379268Abcamab120196
L-AP4Abcamab120002
CNQXAbcamab120044
MPEPAbcamab120008
TRIzol试剂Invitrogen--
RT2第一链合成试剂盒Qiagen--
小鼠GABA和谷氨酸RT2谱仪PCR阵列QiagenPAMM-152ZF
SYBR Green qPCR预混液Qiagen--
铂Taq DNA聚合酶Invitrogen--
Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪Roche Diagnostics--
GelGreenBiotium--
20 bp DNA梯Jena Bioscience--
Fusion FX7成像系统Vilber Lourmat--
抗mGluR5抗体Alomone LabsAGC-007
抗GRIK3抗体Alomone LabsAGC-040
抗GRIK4抗体Alomone LabsAGC-041
抗GRIK5抗体Alomone LabsAGC-042
GRIA3抗体LifeSpan BiosciencesLS-C331307
抗GluR4抗体Alomone LabsAGC-019
Alexa Fluor 488山羊抗兔IgGInvitrogen--
Hoechst 33342Sigma-Aldrich--
Vectashield防淬灭剂Vector Laboratories--
兔γ球蛋白对照Invitrogen31887
甘氨酸Merck--
Triton X-100Sigma-Aldrich--
DeadEnd荧光TUNEL系统Promega--
CDX2抗体Cell Signaling Technology--
Cy3偶联山羊抗兔IgGJackson ImmunoResearch Laboratories--
共聚焦显微镜LeicaTCS SPE
荧光显微镜OlympusBX51
ImageJ----

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物与胚胎收集
小鼠品系为ICR (CD-1 IGS);卵母细胞收集于hCG后12-14h,囊胚收集于hCG后96h;使用eCG和hCG进行超排
阅读提示:Materials and methods - Animals, collection of in vivo developed oocytes, and blastocysts
胚胎培养与处理
培养基于EmbryoMax KSOM;谷氨酸浓度2、5、10mM;激动剂浓度(如5mM AMPA, 1mM KA等);拮抗剂浓度CNQX 300μM, MPEP 10μM,预处理20min
阅读提示:Materials and methods - Embryo culture and morphological evaluation
细胞死亡与细胞计数
TUNEL检测细胞死亡,CDX2染色区分TE/ICM,Hoechst 33342计数,手动计数使用ImageJ
阅读提示:Materials and methods - Embryo culture and morphological evaluation
统计设计
统计方法:单因素方差分析和Tukey检验或t检验;显著性P<0.05;各实验组样本量如n=44等
阅读提示:Materials and methods - Statistical analysis