谷氨酸受体表达分析
确定小鼠卵母细胞和囊胚中谷氨酸受体的表达谱。
通过RT-PCR分析15种离子型和8种代谢型谷氨酸受体转录本,并通过免疫荧光检测GRIA3、GRIA4、GRIK3、GRIK4、GRIK5和GRM5蛋白表达。
Glutamate can act as a signaling molecule in mouse preimplantation embryos†
基因表达(RT-PCR)、蛋白表达(免疫荧光)、功能实验(激动剂/拮抗剂)及体内模型,覆盖分子-细胞-胚胎多个层级。
小鼠排卵卵母细胞 小鼠体内发育囊胚
谷氨酸处理方法:L-谷氨酸(Sigma-Aldrich)浓度2、5、10mM,培养24h 激动剂处理:AMPA、海人藻酸、NMDA、DHPG、LY379268、L-AP4的浓度和孵育时间 拮抗剂预处理:CNQX和MPEP浓度(300μM和10μM)及预处理20min 囊胚分组样本量:如对照n=44,GlAc2mM n=51等 统计方法:单因素方差分析和Tukey检验,P<0.05为显著
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定小鼠卵母细胞和囊胚中谷氨酸受体的表达谱。
通过RT-PCR分析15种离子型和8种代谢型谷氨酸受体转录本,并通过免疫荧光检测GRIA3、GRIA4、GRIK3、GRIK4、GRIK5和GRM5蛋白表达。
检测细胞外谷氨酸浓度升高是否影响囊胚发育。
将囊胚培养于含L-谷氨酸(2,5,10mM)的KSOM培养基24h,评估细胞数和死亡细胞比例。
确定哪些受体亚型参与介导谷氨酸的作用。
使用AMPA、海人藻酸、NMDA、DHPG、LY379268、L-AP4刺激囊胚,观察发育指标。
验证AMPA/海人藻酸和GRM5受体是谷氨酸效应所必需。
先用CNQX和MPEP预处理囊胚20min,再加入5mM L-谷氨酸培养24h,评估发育指标。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 胚胎培养 | EmbryoMax KSOM培养基 | Millipore | MR-020P |
| L-谷氨酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| NMDA | Abcam | ab120052 | |
| AMPA | Abcam | ab120005 | |
| 海人藻酸 | Abcam | ab120100 | |
| (S)-3,5-二羟基苯甘氨酸 | Abcam | ab120007 | |
| LY 379268 | Abcam | ab120196 | |
| L-AP4 | Abcam | ab120002 | |
| 拮抗剂处理 | CNQX | Abcam | ab120044 |
| MPEP | Abcam | ab120008 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| cDNA合成 | RT2第一链合成试剂盒 | Qiagen | -- |
| PCR阵列 | 小鼠GABA和谷氨酸RT2谱仪PCR阵列 | Qiagen | PAMM-152ZF |
| PCR | SYBR Green qPCR预混液 | Qiagen | -- |
| 铂Taq DNA聚合酶 | Invitrogen | -- | |
| RT-PCR | Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪 | Roche Diagnostics | -- |
| 电泳 | GelGreen | Biotium | -- |
| 20 bp DNA梯 | Jena Bioscience | -- | |
| 凝胶成像 | Fusion FX7成像系统 | Vilber Lourmat | -- |
| 免疫荧光 | 抗mGluR5抗体 | Alomone Labs | AGC-007 |
| 抗GRIK3抗体 | Alomone Labs | AGC-040 | |
| 抗GRIK4抗体 | Alomone Labs | AGC-041 | |
| 抗GRIK5抗体 | Alomone Labs | AGC-042 | |
| GRIA3抗体 | LifeSpan Biosciences | LS-C331307 | |
| 抗GluR4抗体 | Alomone Labs | AGC-019 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG | Invitrogen | -- | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Vectashield防淬灭剂 | Vector Laboratories | -- | |
| 兔γ球蛋白对照 | Invitrogen | 31887 | |
| 胚胎固定与透化 | 甘氨酸 | Merck | -- |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | -- | |
| TUNEL检测 | DeadEnd荧光TUNEL系统 | Promega | -- |
| 免疫荧光 | CDX2抗体 | Cell Signaling Technology | -- |
| Cy3偶联山羊抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | -- | |
| 显微镜观察 | 共聚焦显微镜 | Leica | TCS SPE |
| 荧光显微镜 | Olympus | BX51 | |
| 图像分析 | ImageJ | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物与胚胎收集 | 小鼠品系为ICR (CD-1 IGS);卵母细胞收集于hCG后12-14h,囊胚收集于hCG后96h;使用eCG和hCG进行超排 阅读提示:Materials and methods - Animals, collection of in vivo developed oocytes, and blastocysts |
| 胚胎培养与处理 | 培养基于EmbryoMax KSOM;谷氨酸浓度2、5、10mM;激动剂浓度(如5mM AMPA, 1mM KA等);拮抗剂浓度CNQX 300μM, MPEP 10μM,预处理20min 阅读提示:Materials and methods - Embryo culture and morphological evaluation |
| 细胞死亡与细胞计数 | TUNEL检测细胞死亡,CDX2染色区分TE/ICM,Hoechst 33342计数,手动计数使用ImageJ 阅读提示:Materials and methods - Embryo culture and morphological evaluation |
| 统计设计 | 统计方法:单因素方差分析和Tukey检验或t检验;显著性P<0.05;各实验组样本量如n=44等 阅读提示:Materials and methods - Statistical analysis |