CLEC14A表达与中性粒细胞浸润的相关性分析
验证CLEC14A在HCC中的表达及其与中性粒细胞浸润的关系。
通过对HCC组织切片进行免疫组化（CLEC14A）和免疫荧光（CD15）染色，量化CLEC14A表达和中性粒细胞数量；分析公共数据集（HEPTROMIC和TCGA）中CLEC14A表达与中性粒细胞特征的相关性。
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CLEC14A与肝细胞癌中性粒细胞浸润相关，并介导中性粒细胞跨肝脏内皮细胞的募集
CLEC14A correlates with neutrophil infiltration in hepatocellular carcinoma and mediates neutrophil recruitment across liver endothelial cells
实验完整度
高包含临床样本分析（HCC组织、活检）、公共数据集分析、空间转录组学、体外细胞实验（siRNA敲低、流式粘附）及体内小鼠模型（Clec14a KO IR损伤），多层次验证了CLEC14A功能。
主要模型
人肝窦内皮细胞（LSEC） Clec14a基因敲除小鼠缺血再灌注肝损伤模型 肝细胞癌患者组织样本
重点核对
CLEC14A表达与中性粒细胞浸润的相关性（免疫组化/免疫荧光） siRNA敲低CLEC14A后中性粒细胞粘附减少 CLEC14A阻断抗体对中性粒细胞招募无影响 Clec14a KO小鼠IR模型中中性粒细胞招募减少
摘要
肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因，预计未来几年病例数将急剧上升。克服HCC中的免疫微环境仍然是一个挑战，而肿瘤相关中性粒细胞等先天免疫群体可能损害免疫治疗的成功。阐明中性粒细胞跨肝脏内皮细胞募集的机制可能为增强免疫治疗疗效提供新方法。CLEC14A是一种内皮特异性受体，调节萌芽性血管生成，在低剪切环境中上调。我们发现CLEC14A在HCC血管和急性肝损伤期间的血管系统中高表达，这使我们假设CLEC14A可能调节中性粒细胞向肝脏和HCC的募集。我们发现，在公共数据集和手术切除的HCC组织中，CLEC14A与中性粒细胞特征和浸润呈正相关。对CLEC14A高表达和低表达肿瘤的空间转录组学（ST）分析证实，髓过氧化物酶在CLEC14A高表达肿瘤中上调，并与其他剪切依赖性标志物相关，但与血管内皮生长因子A呈负相关。为了扩展我们的相关性研究，我们探讨了CLEC14A在肝脏内皮中中性粒细胞募集中的作用。我们使用基于流动的人肝脏内皮测定法进行了体外募集研究，并使用了中性粒细胞募集的体内模型。使用siRNA敲低CLEC14A和针对CLEC14A的特异性阻断抗体，我们发现CLEC14A敲低阻断了中性粒细胞与肝脏内皮的牢固粘附，但这与其已知配体MMRN2的相互作用无关。最后，我们证实Clec14a缺陷在缺血再灌注肝损伤模型中导致中性粒细胞穿过肝窦的募集显著减少。我们揭示了血管生成受体CLEC14A与中性粒细胞募集之间的联系。靶向肿瘤内皮上的CLEC14A可能是调节HCC中性粒细胞浸润的新方法。© 2026 Author(s)。《The Journal of Pathology》由John Wiley & Sons Ltd代表大不列颠及爱尔兰病理学会出版。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CLEC14A是否调节中性粒细胞向肝脏和肝细胞癌的募集？
- 核心机制
- CLEC14A通过介导中性粒细胞与肝脏内皮的牢固粘附促进中性粒细胞募集，该过程不依赖其配体MMRN2，但依赖其肝素结合位点。
- 主要证据
- 人肝组织免疫组化显示CLEC14A在炎症和肿瘤血管上调；公共数据集及手术样本显示CLEC14A与中性粒细胞浸润正相关；体外siRNA敲低和阻断抗体实验表明CLEC14A影响中性粒细胞牢固粘附；体内Clec14a KO小鼠IR模型证实中性粒细胞募集减少。
- 研究意义
- 靶向肿瘤内皮上的CLEC14A可能是调节HCC中中性粒细胞浸润的新方法，为改善免疫治疗提供潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
空间转录组学分析
比较CLEC14A高表达和低表达肿瘤的基因表达差异，探索与中性粒细胞招募相关的通路。
使用NanoString GeoMx数字空间剖面技术对选定肿瘤区域进行转录组分析，鉴定差异表达基因和通路。
体外LSEC功能实验
验证CLEC14A在肝窦内皮细胞中的功能，特别是对中性粒细胞粘附的影响。
分离原代人LSEC，进行siRNA敲低CLEC14A后，进行静态和流动粘附实验，检测中性粒细胞粘附情况；同时检测CLEC14A重组蛋白与中性粒细胞的结合。
体内IR损伤模型
在体内多细胞环境中验证CLEC14A对中性粒细胞募集的影响。
对Clec14a基因敲除小鼠和野生型小鼠进行肝脏缺血再灌注（IR）损伤，通过活体显微镜观察中性粒细胞在肝窦中的募集。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组化/免疫荧光 | CLEC14A多克隆抗体 | Bio-Techne | -- |
| 抗绵羊HRP | Bio-Techne | -- | |
| 小鼠抗人CD15（克隆MC480） | CST | -- | |
| 山羊抗小鼠Alexa Fluor | Invitrogen | -- | |
| 细胞培养 | 人内皮无血清培养基 | Gibco | -- |
| 人血清 | TCS Biosciences | -- | |
| 血管内皮生长因子 | Peprotech | -- | |
| 肝细胞生长因子 | Peprotech | -- | |
| Western blot | Amersham ECL蛋白质印迹检测试剂 | Cytiva/GE Healthcare | -- |
| LI-COR Odyssey成像仪 | LI-COR Biotechnology | -- | |
| Restore蛋白质印迹剥离缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Multi-merin-2抗体 | Abcam | -- | |
| β-肌动蛋白抗体 | Merck | -- | |
| HRP偶联抗小鼠IgG抗体 | Agilent | -- | |
| HRP偶联抗兔IgG抗体 | Abcam | -- | |
| RT-qPCR | TaqMan基因表达检测试剂盒 | Applied Biosystems | -- |
| Taqman 2×预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| RNA干扰 | 靶向CLEC14A的siRNA | Thermo Fisher Scientific | Assay |
| OptiMEM培养基 | Gibco | -- | |
| RNAiMAX脂质体转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 细胞培养 | Ibidi μ-载玻片（涂有大鼠尾胶原） | Thistle Scientific | -- |
| 缺氧处理 | RS Mini Galaxy培养箱 | Wolf Laboratories | -- |
| 中性粒细胞分离 | Histopaque 1199 | Sigma | -- |
| Histopaque 1077 | Sigma | -- | |
| 淋巴细胞分离 | Lympholyte细胞分离液 | Cedarlane | -- |
| RPMI培养基 | Gibco | -- | |
| Matrigel实验 | Matrigel基质胶 | 文中未明确说明 | -- |
| 细胞功能实验 | Cell IQ活细胞成像系统 | CM Technologies | -- |
| 白细胞结合实验 | CLEC14A胞外域-Fc融合蛋白 | R&D Systems | -- |
| 人Fc片段 | Sigma | -- | |
| Invitrogen Zenon人IgG标记试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| 流式细胞术 | CyAn流式细胞仪 | Beckman Coulter Life Sciences | -- |
| Flow Jo软件 | Water Biosciences | -- | |
| 细胞处理 | 肿瘤坏死因子α | Peprotech | -- |
| 空间转录组学 | NanoString GeoMx数字空间剖面系统 | Bruker Spatial Biology | -- |
| GeoMx RNA载玻片制备试剂盒 | Bruker Spatial Biology | -- | |
| 蛋白酶K溶液 | Agilent | -- | |
| 10%中性缓冲福尔马林 | CellPath | -- | |
| NBF终止缓冲液 | Bruker Spatial Biology | -- | |
| Grace Bio-labs HybriSlip杂交盖片 | Sigma | -- | |
| Alexa532标记CD3抗体 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Alexa594标记CD34抗体 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Alexa647标记PanCK抗体 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SYTO13核酸染料 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 组织处理与染色 | 组织类型（正常/炎症/肿瘤）及染色抗体（CLEC14A多克隆抗体，CD15抗体） 阅读提示：见Methods部分：组织学评估 |
| 原代LSEC分离与培养 | 肝脏来源（健康/肝硬化），培养基成分（人内皮无血清培养基，10%人血清，VEGF，HGF） 阅读提示：见Methods部分：原代人LSEC分离 |
| RNA干扰 | siRNA序列（D1和D2），转染试剂（RNAiMAX），用量（20μM），时间（48h） 阅读提示：见Methods部分：RNA干扰 |
| 中性粒细胞分离 | 密度梯度离心方法（Histopaque 1199/1077），离心条件（500×g，45min） 阅读提示：见Methods部分：人中性粒细胞分离 |
| 粘附实验 | LSEC是否预处理（剪切力，siRNA敲低），TNFα浓度（10μg/ml）和时间（24h），中性粒细胞数量（100,000/ml），共孵育时间（5min），流动实验剪切力（0.05 Pa） 阅读提示：见Methods部分：中性粒细胞静态和流动粘附实验 |
| 体内IR模型 | 小鼠品系（Clec14a KO和WT），年龄（8周），IR手术方法，中性粒细胞标记（GR-1抗体），观察时间 阅读提示：见Methods部分：缺血再灌注损伤和肝脏活体显微镜 |