建立CAC小鼠模型及手术干预
评估阑尾切除术和阑尾炎诱导对AOM/DSS诱导的CAC肿瘤发生的影响。
5周龄雄性BALB/c小鼠随机分为阑尾切除术、阑尾炎诱导或假剖腹术组，术后接受AOM/DSS方案（AOM注射后1周开始3个DSS周期），12周后处死，取结肠进行肿瘤计数和病理分析。
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阑尾协调结肠炎相关癌症中的T细胞介导免疫监视
The Appendix Orchestrates T-Cell Mediated Immunosurveillance in Colitis-Associated Cancer
实验完整度
高涉及小鼠CAC模型（AOM/DSS）、DSS-only模型、surgery-only模型，以及人类UC患者的肿瘤样本，包含功能验证（T细胞阻断、过继转移）和机制验证（免疫组化、流式细胞术）。
主要模型
BALB/c小鼠AOM/DSS结肠炎相关癌症模型 BALB/c小鼠DSS-only慢性结肠炎模型 BALB/c小鼠手术-only模型 人溃疡性结肠炎相关癌症肿瘤样本
重点核对
手术方式：阑尾切除术、阑尾炎诱导、假剖腹术 AOM剂量：10 mg/kg腹腔注射 DSS浓度和周期：1.5% DSS三周期（7天、7天、4天） T细胞运输阻断：抗α4β7整合素抗体125μg/100μL或FTY720 60μg/100μL腹腔注射，每周两次 T细胞过继转移：5×10^5个活细胞经眶后静脉窦注射
摘要
背景与目的：尽管阑尾切除术可能减轻溃疡性结肠炎（UC）患者的结直肠炎症，但该手术被认为可能与结肠炎相关癌症（CAC）风险增加有关。我们的目的是探讨阑尾切除术相关CAC风险增加的机制。方法：对5周龄雄性BALB/c小鼠实施阑尾切除术、阑尾炎诱导或假剖腹术。随后暴露于氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠（AOM/DSS）以诱导CAC。12周后处死小鼠，取结肠进行病理分析和免疫组化（CD3和CD8染色）。对21例因CAC接受手术切除的UC患者的结肠肿瘤进行免疫表型分析，并根据阑尾切除术史进行分层。结果：阑尾切除术显著减轻结肠炎严重程度并增加CAC数量，而未行阑尾切除术的阑尾炎诱导则导致相反结果。与假剖腹术组相比，阑尾切除术后瘤内CD3+和CD8+ T细胞密度较低，而阑尾炎诱导后较高。使用抗α4β7整合素抗体或鞘氨醇-1-磷酸受体激动剂阻断淋巴细胞向结肠的运输，抑制了阑尾切除术对肿瘤数量和CD3+/CD8+瘤内密度的促进作用。从炎性新生阑尾中分离的CD8+或CD3+ T细胞经静脉注射到经AOM/DSS处理的受体小鼠中，增加了CD3+/CD8+ T细胞肿瘤浸润并减少了肿瘤数量。在有阑尾切除术史的UC患者中，与无阑尾切除术史的患者相比，瘤内CD3+和CD8+ T细胞密度降低。结论：在UC中，阑尾切除术可能抑制T细胞 priming 的主要部位，导致CAC免疫监视效率降低。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 阑尾切除术增加UC患者结肠炎相关癌症风险的机制是什么？
- 核心机制
- 阑尾切除术抑制了阑尾作为T细胞priming的主要部位，导致瘤内CD3+和CD8+ T细胞浸润减少，从而降低CAC的免疫监视。
- 主要证据
- 在小鼠AOM/DSS模型中，阑尾切除术增加肿瘤数量并减少瘤内CD3+/CD8+ T细胞密度；阻断T细胞运输（抗α4β7或FTY720）模拟阑尾切除术效应；过继转移阑尾primed T细胞保护小鼠；人类UC-CAC样本中，有阑尾切除术史的患者瘤内T细胞密度降低。
- 研究意义
- 研究揭示了阑尾在CAC免疫监视中的关键作用，提示若阑尾切除术成为UC的治疗选择，需谨慎考虑其潜在风险。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估结肠炎严重程度
确定阑尾切除术对慢性结肠炎严重程度的影响，以区分炎症和肿瘤发生的独立作用。
使用DSS-only协议（无AOM注射）诱导慢性结肠炎，评估体重变化、结肠长度和结肠炎组织学范围。
分析肿瘤分子和微生物特征
探索阑尾切除术是否通过改变肿瘤分子特征或肠道菌群影响肿瘤发生。
对肿瘤进行转录组微阵列分析，评估PCNA增殖，检测粪便菌群16S rRNA，并通过定量PCR检测肿瘤内Fusobacterium nucleatum。
评估瘤内T细胞浸润和表型
评估阑尾切除术对瘤内T细胞数量和功能的影响。
通过免疫组化检测CD3和CD8，流式细胞术分析T细胞记忆/效应表型（CD62L, CD44）和PD1表达，并通过ELISA检测刺激后TNF-α和IFN-γ产生。
验证T细胞运输在阑尾切除术效应中的作用
验证阑尾切除术的促肿瘤效应是否通过减少T细胞向肠道运输介导。
使用抗α4β7整合素抗体或FTY720阻断淋巴细胞运输，比较阑尾切除术和假手术组在阻断条件下的肿瘤数量和T细胞浸润。
验证阑尾炎诱导的保护效应
评估诱导阑尾炎是否通过增强T细胞免疫监视发挥保护作用。
对小鼠进行阑尾炎诱导，随后进行AOM/DSS或DSS-only方案，评估肿瘤数量和T细胞浸润。
过继转移实验验证阑尾primed T细胞功能
验证阑尾中primed的CD3+和CD8+ T细胞是否能够保护受体小鼠免受CAC。
从阑尾炎诱导的供体小鼠中分离纯化CD3+、CD8+ T细胞和CD45+CD3-细胞，通过眶后静脉窦注射到受体小鼠，随后进行AOM/DSS方案，比较肿瘤数量和T细胞浸润。
人类UC-CAC样本验证
验证小鼠模型中发现的现象是否在人类UC患者中一致。
收集UC合并CAC患者的肿瘤样本，根据阑尾切除术史分组，通过免疫组化检测CD3和CD8密度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 氧化偶氮甲烷 | Sigma-Aldrich | -- |
| 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomedicals | -- | |
| 异氟烷 | -- | -- | |
| 免疫组化 | 抗CD3抗体 | Abcam | ab16669 |
| 抗CD8抗体 | Abcam | ab209775 | |
| 抗PCNA抗体 | Biotechnology | Sc-56 | |
| 免疫组化（人类样本） | 抗CD3抗体 | Dako | A0452 |
| 抗CD8抗体 | Dako | M7103 | |
| T细胞分离 | 含GlutaMAX的RPMI 1640培养基 | Gibco | 61870-010 |
| IV型胶原酶 | Serlabo | LS004188 | |
| DNA酶 | Sigma-Aldrich | DN25-100MG | |
| 小鼠CD90.2微珠 | Miltenyi | 130-121-278 | |
| 流式细胞术 | 小鼠Fc受体阻断剂 | Miltenyi | 130-092-575 |
| LIVE/DEAD可固定水族死细胞染色试剂盒-AmCyan | Thermo Fisher Scientific | L34957 | |
| 抗CD3抗体（APC-Vio770） | Miltenyi | 130-119-793 | |
| 抗CD4抗体（FITC） | Miltenyi | 130-118-692 | |
| 抗CD8抗体（PE-Vio770） | Miltenyi | 130-119-123 | |
| 抗CD62L抗体（APC） | Miltenyi | 130-112-837 | |
| 抗CD44抗体（PE） | Miltenyi | 130-118-694 | |
| 抗PD1抗体（PE-CF594） | BD | 562523 | |
| ELISA | PMA/离子霉素刺激混合物 | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88-7324-22 | |
| IFN-γ ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88-7314-22 | |
| 转录组分析 | RNAble试剂盒 | Eurobiom | -- |
| GeneChip WT Plus试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| GeneChip MouseGene2.0ST芯片 | Affymetrix | -- | |
| 菌群分析 | QIAamp快速粪便DNA迷你试剂盒 | Qiagen | 51604 |
| Qubit dsDNA高灵敏度检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | |
| Nextera XT索引试剂盒 | Illumina | -- | |
| Agencourt AMPure磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| KAPA文库定量试剂盒 | Roche | -- | |
| Illumina Miseq测序平台 | Illumina | -- | |
| F. nucleatum检测 | DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | -- |
| MesaBlue qPCR预混液 | Eurogentec | -- | |
| LightCycler 480实时荧光定量PCR仪 | Roche Diagnostics | -- | |
| T细胞运输阻断 | InVivoMAb抗小鼠LPAM-1（整合素α4β7） | Bio X Cell | BE0034 |
| FTY720 | Sigma-Aldrich | SML0700 | |
| T细胞过继转移 | 小鼠CD8a+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi | 130-104-075 |
| 小鼠CD45微珠 | Miltenyi | 130-052-301 | |
| 病理分析 | Scanscope AT turbo数字切片扫描仪 | Leica | -- |
| Aperio ImageScope软件 | -- | -- | |
| 流式细胞术分析 | LSRFortessa流式细胞仪 | BD | -- |
| FlowJo v10软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系、性别、年龄、来源 阅读提示：Methods - Animal Models |
| 手术操作 | 阑尾切除术、阑尾炎诱导、假手术的具体操作步骤 阅读提示：Methods - Surgical Procedures |
| CAC诱导 | AOM剂量、DSS浓度和周期 阅读提示：Methods - Animal Models |
| T细胞运输阻断 | 抗α4β7或FTY720剂量、给药频率和周期 阅读提示：Methods - Blocking Lymphocyte Trafficking |
| T细胞过继转移 | 供体处理、细胞分离方法、注射细胞数和途径 阅读提示：Methods - Transfers of Systemic Immune Cells Isolated From Inflamed Appendices |
| 人类样本 | 患者纳入标准、阑尾切除术史确认方法 阅读提示：Methods - Human Samples |
| 病理评估 | 肿瘤计数方法、结肠炎范围评估、T细胞密度定量方法 阅读提示：Methods - Pathology and Immunohistochemistry |