筛选肠道微生物代谢物对AhR的激活
系统评估57种菌群依赖代谢物激活AhR的能力。
使用HepG2luc和HT29luc报告细胞进行高内涵筛选，通过荧光素酶活性测定评估AhR活性，并排除细胞毒性。
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丁酸通过抑制HDAC增强肠道微生物来源配体对芳烃受体的激活
Butyrate acts through HDAC inhibition to enhance aryl hydrocarbon receptor activation by gut microbiota-derived ligands
实验完整度
高包含体外细胞系筛选、人结肠外植体验证、放射性配体结合、免疫荧光、Co-IP、ChIP等机制实验，且有多层次功能验证。
主要模型
HepG2肝癌细胞系及AhR报告细胞HepG2-Lucia HT29肠上皮细胞系及AhR报告细胞HT29-Lucia LS180结肠上皮细胞系 人结肠外植体 Hepa1c1c7小鼠肝癌细胞系
重点核对
AhR报告细胞系处理浓度：丁酸10 mM，FICZ 10-100 ng/mL 放射性配体结合实验使用[3H]-TCDD和Hepa1c1c7细胞 人结肠外植体处理浓度：丁酸0.01-0.1 mM联合FICZ 10-100 ng/mL ChIP实验使用HepG2细胞，处理时间180分钟
摘要
芳烃受体（AhR）是肠道微生物与宿主之间串扰的关键参与者。然而，在复杂的代谢环境中，调节肠道内AhR的因素知之甚少。本研究探讨了代谢物组合对AhR激活机制的影响。使用荧光素酶报告系统和AhR靶基因mRNA水平在人细胞系和人结肠外植体中评估AhR活性。通过放射性配体结合实验研究AhR激活，通过免疫荧光研究AhR核转位，并通过AhR与ARNT的蛋白质免疫共沉淀研究AhR激活。使用几种测试和抑制剂评估AhR的间接激活。通过染色质免疫沉淀和使用组蛋白去乙酰化酶HDAC抑制剂(iHDAC)研究靶基因CYP1A1的启动子。短链脂肪酸，尤其是丁酸，在不结合受体的情况下增强内源性色氨酸代谢物介导的AhR活性。这一效应在人类肠道外植体中得到证实，且不依赖于短链脂肪酸靶向受体的激活、AhR降解的抑制或其配体的清除。丁酸直接作用于AhR靶基因启动子，通过iHDAC活性重塑染色质。我们的研究结果揭示，丁酸不是AhR配体，而是作为iHDAC，在色氨酸衍生的AhR激动剂存在下，增加AhR向靶基因启动子的募集。这些数据有助于对肠道微生物来源代谢物调控AhR激活的复杂机制产生新的理解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肠道微生物代谢物（特别是丁酸）如何调节AhR的激活？
- 核心机制
- 丁酸通过抑制组蛋白去乙酰化酶（HDAC）改变染色质构象，促进AhR配体复合物与靶基因启动子结合，从而增强AhR转录活性。
- 主要证据
- 在HepG2和HT29细胞系以及人结肠外植体中，丁酸与FICZ或IAA联合处理显著增强CYP1A1和AHRR表达；ChIP实验显示丁酸增加AhR向CYP1A1启动子的募集。
- 研究意义
- 揭示肠道代谢物复杂交互作用，为通过产生丁酸和吲哚的活体生物治疗产品或代谢物混合物调节肠道AhR活性提供新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证丁酸与已知AhR激动剂的协同效应
在无血清条件下，评估丁酸与FICZ或IAA联合是否增强AhR活性。
在HepG2、HT29细胞及报告细胞中，使用丁酸、丙酸、乙酸与FICZ或IAA联合处理，检测荧光素酶活性和CYP1A1、AHRR mRNA表达。
验证丁酸直接与AhR结合的能力
确定丁酸是否为AhR配体。
使用Hepa1c1c7细胞进行放射性配体结合实验，检测丁酸、丙酸、乙酸对[3H]-TCDD结合的竞争能力；并通过免疫荧光检测AhR核转位、Co-IP检测AhR-ARNT二聚体形成。
排除间接机制
排除丁酸通过抑制CYP1A1、激活GPCR或抑制蛋白酶体增强AhR活性的可能性。
使用CYP1A1酶活性测定、GPCR拮抗剂（MB）、蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞，检测AhR活性。
验证丁酸通过HDAC抑制增强AhR活性
验证丁酸是否通过抑制HDAC增强AhR活性，并探讨其机制。
使用HDAC抑制剂TSA处理细胞，检测AhR活性；染色质免疫沉淀（ChIP）检测AhR在CYP1A1启动子的富集；使用HAT抑制剂C646检测组蛋白乙酰转移酶的作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | EMEM培养基 | ATCC | 30-2003 |
| DMEM培养基 | Gibco | 41965 | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素和链霉素 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| MEM非必需氨基酸 | Sigma | M7145 | |
| 处理试剂 | 丁酸钠 | Sigma Aldrich | 303410 |
| 乙酸钠 | Sigma Aldrich | S2889 | |
| FICZ | Sigma Aldrich | SML1489 | |
| 吲哚乙酸 | Sigma Aldrich | I3750 | |
| 美喷佐溴铵 | Sigma Aldrich | M5651 | |
| MG132 | Sigma Aldrich | M8699 | |
| 曲古抑菌素A | Sigma Aldrich | T8552 | |
| C646 | Sigma Aldrich | 382113 | |
| 丙戊酸 | Sigma Aldrich | P4543 | |
| TCDD | -- | -- | |
| 细胞培养 | HepG2-Lucia AhR报告细胞 | Invivogen | hpgl-ahr |
| HT29-Lucia AhR报告细胞 | Invivogen | ht2l-ahr | |
| AhR活性检测 | Quanti-Luc荧光素酶底物 | InvivoGen | -- |
| 细胞毒性检测 | CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒 | Promega | -- |
| 基因表达分析 | TRIzol试剂 | Ambion | 15596018 |
| RT-qPCR | 高效cDNA逆转录试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 4368814 |
| SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | 4309155 | |
| StepOne Plus实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| CYP1A1抑制实验 | 重组人CYP1A1蛋白 | Sigma Aldrich | C3735 |
| P450-Glo CYP1A1检测试剂盒 | Promega | V8751 | |
| NADPH再生系统 | Promega | V9510 | |
| α-萘黄酮 | -- | -- | |
| ChIP | AhR抗体(D5S6H) | Cell Signaling Technology | 83200 |
| 兔源正常IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| H3抗体(D2B12) | Cell Signaling Technology | 4620 | |
| ChIP级Protein G磁珠 | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| Bioruptor Pico超声破碎仪 | Diagenode | -- | |
| Nanodrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| NucleoSpin凝胶和PCR清洁试剂盒 | Macherey-Nagel | 740609 | |
| 免疫共沉淀 | Pierce免疫共沉淀试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 26149 |
| ARNT抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17812 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠二抗 | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| WesternSure PREMIUM化学发光底物 | LI-COR Biotechnology | -- | |
| C-DiGit扫描仪 | LI-COR Biotechnology | -- | |
| Re-Blot Plus强效剥离液 | Millipore | -- | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488标记的抗AhR抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-133088 |
| DAPI染料 | -- | -- | |
| VectaShield抗荧光淬灭封片剂 | Vector Laboratories | -- | |
| 奥林巴斯Fluoview 1000共聚焦系统 | Olympus | -- | |
| 细胞培养 | 多聚-D-赖氨酸包被8孔腔室玻片 | Sarstedt | -- |
| 人结肠外植体培养 | RPMI Glutamax培养基 | Gibco | 61870-010 |
| 庆大霉素 | Sigma Aldrich | G1264 | |
| 两性霉素B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| RNA保护液 | Sigma Aldrich | R0901 | |
| 放射配体结合实验 | [3H]-TCDD | -- | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 7 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基类型、血清浓度、CO2浓度、传代条件 阅读提示：Materials and methods, Cell culture and maintenance |
| AhR报告基因实验 | 细胞系（HepG2-Lucia, HT29-Lucia）、处理浓度、处理时间、是否含血清、重复次数 阅读提示：Materials and methods, Measurement of AhR activity; Results, Figure 1 and 2 |
| 放射配体结合实验 | 细胞裂解液来源、[3H]-TCDD浓度、竞争配体浓度、孵育时间、检测方法 阅读提示：Materials and methods, Radio-ligand binding assay; Results, Figure 3a |
| AhR核转位和异二聚化实验 | 细胞系（LS180）、处理浓度（丁酸10 mM, FICZ 10 nM）、处理时间（90分钟）、抗体信息 阅读提示：Materials and methods, Immunofluorescence detection and Co-immunoprecipitation; Results, Figure 3c-e |
| ChIP实验 | 细胞系（HepG2）、处理浓度（丁酸1 mM, FICZ 10 ng/mL）、处理时间（180分钟）、抗体、引物序列、qPCR程序 阅读提示：Materials and methods, Chromatin immunoprecipitation; Results, Figure 4b-c |