体外药物敏感性检测
评估rMV-Hu191与顺铂联合对胃癌细胞增殖的抑制作用及协同效应。
使用CCK-8实验检测不同浓度组合下细胞活力，并通过ZIP分析计算协同评分。
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rMV-Hu191联合顺铂通过酸性鞘磷脂酶介导的凋亡治疗胃癌，需要脂筏微结构域的完整性
Synergism of rMV-Hu191 with cisplatin to treat gastric cancer by acid sphingomyelinase-mediated apoptosis requiring integrity of lipid raft microdomains
实验完整度
中包含体外细胞实验（增殖、凋亡、蛋白表达）、体内异种移植瘤模型及机制验证（ASMase和脂筏），但缺乏患者样本或组学数据。
主要模型
人胃癌细胞系BGC-823 人胃癌细胞系SGC-7901 多药耐药胃癌细胞系GCSR1 胃癌异种移植瘤裸鼠模型
重点核对
细胞系：BGC-823、SGC-7901和GCSR1的细胞培养条件（培养基及FBS浓度） rMV-Hu191感染复数（MOI）和顺铂剂量（如BGC-823: MOI=0.1, DDP=0.6μM；SGC-7901: MOI=1, DDP=2.8μM） 凋亡检测：Annexin V FITC凋亡检测试剂盒（BD）及流式细胞仪；Western blot检测caspase-3和PARP表达 脂筏破坏：MβCD浓度及处理时间（7.5mM预处理2h，2mM处理48h） ASMase抑制：丙咪嗪浓度（BGC-823: 25μM, SGC-7901: 50μM）及处理时间（感染后72h）
摘要
背景
基于DDP的化疗是GC的一线治疗方法之一。然而，由于副作用，DDP的治疗效果有限。因此，开发与DDP协同的新型佐剂具有重要意义。我们先前已证明rMV-Hu191在GC中具有抗肿瘤活性。在此，我们检测了rMV-Hu191与DDP在体内外的协同作用。
方法
通过CCK-8实验、ZIP分析和流式细胞术分别评估细胞增殖、协同效应和细胞凋亡。通过Western blot和免疫荧光实验监测ASMase的蛋白水平和定位。使用shRNA和丙咪嗪调节ASMase的表达和活性。使用MβCD破坏脂筏。通过携带GC异种移植瘤的小鼠来证实体内协同作用。
结果
我们的数据显示，联合治疗在来自中国患者的耐药GC细胞系和非耐药GC细胞系中均表现出协同细胞毒性，并增加细胞凋亡，而非病毒复制。脂筏完整性和ASMase是rMV-Hu191和联合治疗诱导凋亡所必需的。ASMase在rMV-Hu191治疗的初始阶段被递送至脂筏微结构域。体内GC小鼠异种移植瘤证实了联合治疗的协同作用，同时凋亡增加且副作用轻微。
结论
这是第一项证明rMV-Hu191联合DDP可作为GC治疗的潜在策略，且ASMase和脂筏完整性是协同效应所必需的研究。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- rMV-Hu191能否与顺铂联合协同抑制胃癌，并探索其潜在机制？
- 核心机制
- rMV-Hu191感染早期激活并促进ASMase转位至脂筏微结构域，与顺铂协同通过caspase依赖性凋亡发挥抗肿瘤作用，此过程依赖脂筏完整性。
- 主要证据
- 体外CCK-8、ZIP分析、流式凋亡检测和Western blot显示联合治疗协同增强凋亡；体内BGC-823异种移植瘤模型显示联合治疗显著抑制肿瘤生长、延长生存期并增加凋亡。
- 研究意义
- 本研究首次证明rMV-Hu191联合顺铂可作为胃癌治疗的潜在策略，为化学病毒疗法提供新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
凋亡检测及机制验证
验证联合治疗是否通过caspase依赖性凋亡诱导细胞死亡。
使用流式细胞术检测Annexin V阳性细胞比例，Western blot检测caspase-3和PARP剪切，并用Z-VAD抑制caspase验证。
病毒复制检测
验证顺铂是否影响rMV-Hu191的复制。
通过TCID50法检测病毒滴度。
脂筏完整性作用研究
验证脂筏完整性在联合治疗诱导凋亡中的作用。
使用MβCD破坏脂筏，检测凋亡比例及凋亡蛋白表达变化。
ASMase功能及表达调控
验证ASMase在联合治疗诱导凋亡中的参与。
使用丙咪嗪抑制ASMase活性，以及shRNA敲低ASMase表达，检测凋亡变化。
ASMase与脂筏共定位分析
探索ASMase是否转位至脂筏微结构域。
通过免疫荧光检测ASMase与脂筏标记物CTB的共定位，并用Western blot检测ASMase表达变化。
耐多药细胞系验证
评估联合治疗在多药耐药胃癌细胞中的效果。
使用GCSR1细胞系检测细胞活力、凋亡及协同效应。
体内抗肿瘤效应评估
验证联合治疗在动物模型中的抗肿瘤效果及安全性。
建立BGC-823异种移植瘤模型，分为四组处理，测量肿瘤体积、生存期及副作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞增殖与药物协同
检测病毒复制
验证分子表达变化
验证机制链路
监测副作用
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Life Technologies | -- |
| DMEM培养基 | Life Technologies | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 药物处理 | 顺铂 | Sigma | P4394 |
| 凋亡抑制 | Z-VAD-FMK | ApexBio | A1902 |
| 脂筏破坏 | 甲基-β-环糊精 | Sigma | 332615 |
| ASMase抑制 | 丙咪嗪 | ApexBio | C4117 |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Dojindo Molecular Technologies | -- |
| 细胞培养 | Opti-MEM培养基 | Life Technologies | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V FITC凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | 556547 |
| 流式分析 | 流式细胞仪（Navios） | Beckman Coulter | -- |
| Flowjo 10.0软件 | Tree Star Inc | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| PVDF膜 | Bio-Rad Laboratories | 1620177 | |
| EZ-ECL检测试剂盒 | Biological Industries | 20-500-120 | |
| 抗β-actin抗体 | CST | 4970S | |
| 抗caspase-3抗体 | CST | 9665S | |
| 抗PARP抗体 | CST | 9542S | |
| 抗酸性鞘磷脂酶（ASMase）抗体 | abcam | ab74281 | |
| 抗flotillin 1抗体 | abcam | ab133497 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG二抗 | CST | 7074S | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗 | CST | 7076S | |
| 免疫荧光 | TritonX-100 | Solarbio | -- |
| 抗麻疹磷蛋白抗体 | abcam | ab43820 | |
| Alexa Fluor® 594 驴抗小鼠IgG (H+L) | Invitrogen | A-21203 | |
| DAPI | Beyotime | C1005 | |
| Zeiss cLSM780显微镜 | Zeiss | -- | |
| Alexa 488偶联的霍乱毒素B亚单位 | Invitrogen | C-34775 | |
| 抗酸性鞘磷脂酶（ASMase）抗体 | abcam | ab83354 | |
| Alexa Fluor® 594 山羊抗兔IgG (H+L) | Invitrogen | A-11012 | |
| 徕卡TCS SP8共聚焦激光扫描显微镜 | Lecia | -- | |
| 动物实验 | 无胸腺裸鼠 | -- | -- |
| 血液生化分析 | 自动化血液生化流水线分析仪 | Beckman Coulter | -- |
| 免疫组化 | 4%福尔马林 | -- | -- |
| TUNEL原位凋亡检测试剂盒 | Takara | MK500 | |
| 光学显微镜 | Leica | -- | |
| 数据分析 | GraphPad Prism 9.0 | GraphPad Software | -- |
| R包"SynergyFinder 1.0." | -- | -- | |
| 质粒包装 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668027 |
| 嘌呤霉素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | BGC-823和GCSR1使用RPMI 1640+10%FBS；SGC-7901使用RPMI 1640+20%FBS；Vero使用DMEM+10%FBS；培养条件为37°C，5%CO2，饱和湿度 阅读提示：Materials and methods 中 “Cell culture and reagents” |
| 体外药物处理 | rMV-Hu191感染24h后加入DDP；处理时间72h；具体MOI和DDP剂量：BGC-823: MOI=0.1, DDP=0.6μM；SGC-7901: MOI=1, DDP=2.8μM；GCSR1: MOI=10, DDP=3μM 阅读提示：Materials and methods 中 “Cell viability assays” 和 “Virus construction, titration and replication assays” |
| 协同效应分析 | 使用ZIP模型，通过R包“SynergyFinder 1.0”计算协同评分 阅读提示：Materials and methods 中 “Zero interaction potency (ZIP) analysis” |
| 凋亡检测 | 细胞密度1×10^6，Annexin V FITC凋亡检测试剂盒（BD）染色，流式检测，每组三个重复；Z-VAD浓度100μM 阅读提示：Materials and methods 中 “Flow cytometry analysis” 和 Figure 1d |
| Western blot | 蛋白上样量30μg；抗体：anti-caspase-3 (CST, 9665S)，anti-PARP (CST, 9542S)，anti-β-actin (CST, 4970S) 阅读提示：Materials and methods 中 “Western blotting” |
| 脂筏破坏 | MβCD浓度：7.5mM预处理2h，2mM处理48h 阅读提示：Materials and methods 中 “Disruption and isolation of cholesterol-rich ‘lipid rafts’” |
| ASMase抑制 | 丙咪嗪浓度：BGC-823 25μM，SGC-7901 50μM，处理72h 阅读提示：Materials and methods 中 “Functional inhibition of ASMase” |
| shRNA敲低 | shASMase和shCtrl质粒从Genechem获得，使用lipofectamine 2000进行慢病毒包装，嘌呤霉素（1:12,000）筛选稳定转染 阅读提示：Materials and methods 中 “Construction of ASMase-knockdown SGC-7901 cell clones” |
| 动物模型 | BGC-823细胞（1×10^6）皮下注射至雄性裸鼠（3-5周龄）；肿瘤体积达到30-50mm³时随机分组（n=10）；rMV-Hu191瘤内注射（1.4×10^7 TCID50，在第5,6,7,9,11,13天），DDP腹腔注射（10mg/kg，在第7,14,21天） 阅读提示：Materials and methods 中 “In vivo antitumor studies” |
| 副作用评估 | 肝肾功能指标：Alb、Glb、AST、ALT、BUN、Cr；体重变化 阅读提示：Materials and methods 中 “Evaluation of side-effects in vivo” 和 Figure 6i-k |