构建肝脏特异性CTCF敲除小鼠模型
研究CTCF在肝脏中的生理功能
将携带floxed CTCF等位基因的小鼠与白蛋白启动子驱动Cre表达的小鼠杂交，获得肝脏特异性CTCF敲除小鼠（cKO），并通过qRT-PCR和Western blot确认CTCF缺失。
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小鼠肝脏特异性敲除CTCF通过增强PPARγ信号导致肝脂肪变性
Liver-Specific Deletion of Mouse CTCF Leads to Hepatic Steatosis via Augmented PPARγ Signaling
实验完整度
高研究包含肝脏特异性CTCF敲除小鼠模型、RNA-seq、ChIP-seq、Hi-C等多层级实验，并通过PPARγ药理学抑制、腺病毒过表达/敲低及CD36敲除进行了功能验证和机制验证。
主要模型
肝脏特异性CTCF敲除小鼠（Alb-cre/Ctcffl/fl） 肝脏特异性CTCF/CD36双敲除小鼠（Alb-cre/Ctcffl/fl/CD36KO） 原代肝细胞
重点核对
小鼠品系及周龄：8-20周龄雄性小鼠，标准饲料喂养 CTCF敲除效率：通过qRT-PCR和Western blot验证肝脏中CTCF的mRNA和蛋白水平 PPARγ抑制方式：GW9662（100 μM）腹腔注射，每日一次，持续2周 PPARγ敲低方式：腺病毒介导的shPPARγ尾静脉注射，处理7天 CD36敲除影响：通过Western blot验证CD36蛋白缺失
摘要
背景与目的：肝脏是脂质代谢的主要器官，肝脏功能障碍可导致多种疾病。非酒精性脂肪性肝病正迅速成为全球主要的健康问题，其特征是肝脏中异常滞留过多的脂质。CCCTC结合因子（CTCF）是一种高度保守的锌指蛋白，调节高阶染色质组织并参与各种基因调控过程。在此，我们旨在确定CTCF在肝脏脂质代谢中的生理作用。方法：我们生成了肝脏特异性CTCF敲除和/或CD36全身敲除小鼠。使用腺病毒实现肝脏中过氧化物酶体增殖物激活受体γ的过表达或敲低。检查小鼠肝脂肪变性和炎症的发展。进行RNA测序以鉴定受CTCF缺失影响的基因。通过染色质免疫沉淀测序分析H3K27乙酰化、PPARγ和CTCF的全基因组占据。通过原位Hi-C分析全基因组染色质相互作用。结果：肝脏特异性CTCF缺陷小鼠在标准饲料喂养时出现肝脂肪变性和炎症。转录组和增强子景观的整体分析显示，CTCF缺失的肝脏表现出PPARγ在细胞核中积累增加，导致其下游靶基因表达增加，包括参与脂质代谢过程的脂肪储存相关基因CD36。通过药理学阻断或腺病毒介导的敲低抑制PPARγ，可改善肝脏特异性CTCF缺陷小鼠的肝脂肪变性，但额外敲除CD36几乎不能挽救。结论：我们的数据表明，肝脏特异性缺失CTCF通过增强PPARγ DNA结合活性导致肝脂肪变性，该活性上调其与脂质代谢过程相关的下游靶基因。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CTCF在肝脏脂质代谢中的生理作用是什么？
- 核心机制
- 肝脏特异性缺失CTCF导致PPARγ蛋白在细胞核中积累增加，增强其DNA结合活性，上调下游参与脂质代谢过程的靶基因（如CD36）的表达，从而促进肝脂肪变性。
- 主要证据
- 肝脏特异性CTCF敲除小鼠在正常饮食下出现肝脂肪变性；RNA-seq和ChIP-seq显示PPARγ靶基因表达增加和增强子活性改变；PPARγ抑制可改善脂肪变性，而CD36敲除不能挽救。
- 研究意义
- 该研究揭示了CTCF是肝脏脂质稳态的关键调控因子，为理解NAFLD的发病机制提供了新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估CTCF缺失对肝脏表型的影响
确定CTCF缺失是否导致肝脂肪变性和肝损伤
通过Oil Red O染色、H&E染色、肝脏TC/TG测定、血清ALT/AST测定、cleaved caspase-3和BrdU染色评估肝脏脂肪变性、损伤和细胞增殖情况。
肝脏转录组和表观基因组分析
鉴定CTCF缺失影响的基因和调控元件
对WT和cKO小鼠肝脏进行RNA-seq和H3K27ac ChIP-seq，分析差异表达基因和差异乙酰化区域，并进行de novo motif分析。
鉴定PPARγ靶基因
验证PPARγ在CTCF缺失肝脏中的DNA结合和靶基因调控
对WT和cKO小鼠肝脏进行PPARγ ChIP-seq，鉴定差异结合峰，并与RNA-seq数据整合，确定PPARγ靶基因。
体外验证CD36和PPARγ在脂肪酸摄取中的作用
验证CD36和PPARγ在CTCF缺失肝细胞脂肪酸摄取中的功能
分离原代肝细胞，用CD36抑制剂SSO和PPARγ抑制剂GW9662处理，通过流式细胞术检测CD36表达和脂肪酸摄取。
体内药理学和基因操作验证PPARγ作用
验证PPARγ在CTCF缺失诱导的肝脂肪变性中的因果作用
对cKO小鼠腹腔注射GW9662（100 μM）每日一次持续2周，或尾静脉注射Ad-shPPARγ，评估肝脏CD36表达、TC/TG水平和组织学变化。同时，在WT小鼠尾静脉注射Ad-PPARγ2观察是否诱导脂肪变性。
评估CD36敲除对肝脂肪变性的影响
确定CD36是否是CTCF缺失诱导脂肪变性的必需因素
将cKO小鼠与CD36全身敲除小鼠杂交，获得双敲除小鼠，评估肝脏TG水平、组织学变化和PPARγ靶基因表达。
分析染色质三维结构
研究CTCF缺失对全基因组染色质组织的影响
对WT和cKO小鼠肝脏进行CTCF ChIP-seq和原位Hi-C，分析CTCF结合、A/B compartment和TAD结构的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | Alb-cre小鼠 | Jackson Laboratory | -- |
| CD36敲除小鼠 | Jackson Laboratory | -- | |
| 化学抑制剂 | 硫代琥珀酰亚胺油酸酯 | Cayman Chemical | -- |
| GW9662 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 重组腺病毒 | Ad-PPARγ2腺病毒 | -- | -- |
| Ad-GFP腺病毒 | -- | -- | |
| Ad-US腺病毒 | -- | -- | |
| Ad-shPPARγ腺病毒 | -- | -- | |
| 组织学分析 | OCT包埋剂 | Sakura Finetek | -- |
| 油红O | Sigma-Aldrich | -- | |
| 代谢分析 | 自动生化分析仪 | Hitachi | 7020 |
| 胆固醇/胆固醇酯检测试剂盒 | Abcam | -- | |
| 甘油三酯检测试剂盒 | Abcam | -- | |
| 泰洛沙泊 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 耐受性测试 | 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| 胰岛素 | Eli Lilly and Company | -- | |
| 血糖仪 | Roche Applied Science | ACCU-CHEK | |
| 免疫组织化学和免疫荧光 | 蛋白封闭液 | Agilent Technologies DAKO | -- |
| VECTASHIELD HardSet抗淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1500 | |
| LSM 700共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| 溴脱氧尿苷 | Invitrogen | 033900 | |
| cleaved caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9664 | |
| F4/80抗体 | Abcam | Ab6640 | |
| 流式细胞术 | FACSVerse流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| CBA Flex Sets试剂盒 | BD Biosciences | -- | |
| 脂肪酸摄取实验 | 游离脂肪酸检测试剂盒 | Abcam | -- |
| qRT-PCR | Hybrid-R总RNA提取试剂盒 | GeneAll Biotechnology | -- |
| PrimeScript RT预混液 | Takara Bio | -- | |
| ABI Quant Studio实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| SYBR Green荧光染料 | Qiagen | -- | |
| Western blot | T-PER组织蛋白提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Super Signal West Pico化学发光底物 | GE Healthcare | -- | |
| Image Quant LAS 4000成像系统 | GE Healthcare | -- | |
| 核质分离 | 细胞分级分离试剂盒 | Cell Signaling Technology | -- |
| RNA-seq | TruSeq RNA样品制备试剂盒 | Illumina | -- |
| 生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| Qubit荧光定量仪 | Invitrogen | -- | |
| Illumina HiSeq 2500测序系统 | Illumina | -- | |
| ChIP-seq | Nextera DNA样品制备试剂盒 | Illumina | -- |
| 原位Hi-C | gentleMACS组织处理器 | Miltenyi Biotec | -- |
| DpnII限制性内切酶 | New England Biolabs | -- | |
| 生物素-14-dATP | Jena Bioscience | -- | |
| Qubit双链DNA高灵敏度检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Dynabeads MyOne链霉亲和素C-1磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Tn5转座酶 | Illumina | -- | |
| Illumina NovaSeq6000测序平台 | Illumina | -- | |
| 抗体 | HNF4α抗体 | Abcam | Ab41898 |
| PPARα抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-398394 | |
| PPARγ抗体 | Cell Signaling Technology | 2443 | |
| CD36抗体 | Novus Biologicals | NB400-144 | |
| CTCF抗体 | Cell Signaling Technology | 2899 | |
| α-tubulin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32293 | |
| HSP90α/β抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-13119 | |
| Lamin B1抗体 | Abcam | Ab133741 | |
| CD36抗体 | BioLegend | 102612 | |
| CD45.2抗体 | eBioscience | 47-0454-82 | |
| DCFDA荧光探针 | Invitrogen | C6827 | |
| 流式细胞术 | 5-(和-6)-羧基-2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯 | Molecular Probes | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | 小鼠基因型（Ctcffl/fl，Alb-cre，CD36KO），周龄（8-20周），性别（雄性），饮食（标准饲料） 阅读提示：Methods中'Mice'部分 |
| 腺病毒注射 | 腺病毒类型（Ad-PPARγ2，Ad-GFP，Ad-US，Ad-shPPARγ），注射途径（尾静脉），处理时间（7天） 阅读提示：Methods中'Preparation of Recombinant Adenovirus'部分 |
| PPARγ抑制 | GW9662剂量（100 μM），给药途径（腹腔注射），给药频率（每日一次），持续时间（2周） 阅读提示：Results中'Pharmacologic Inhibition of PPARγ Affects CD36 Expression and Lipid Levels in CTCF-Deficient Livers'部分 |
| CD36抑制 | SSO浓度（文中未明确说明具体浓度），处理时间（文中未明确说明），检测方法（流式细胞术） 阅读提示：Results中'Increased CD36 expression and fatty acid uptake in CTCF-deficient liver'部分 |
| 生化分析 | 肝脏TC/TG检测试剂盒（Abcam），血清ALT/AST检测方法（自动生化分析仪），取材前是否禁食（过夜） 阅读提示：Methods中'Metabolic Analysis'部分 |
| 组织学分析 | 固定液（4%多聚甲醛），包埋剂（石蜡或OCT），切片厚度（5μm或10μm），染色方法（H&E或Oil Red O） 阅读提示：Methods中'Histologic Analysis'部分 |
| 流式细胞术 | ROS检测探针（CM-H2DCFDA）浓度（1 μmol/L），孵育时间（30分钟），孵育温度（37°C），流式细胞仪型号（FACSVerse或LSRFortessa） 阅读提示：Methods中'Flow Cytometry'部分 |
| RNA-seq | RNA提取试剂盒（Hybrid-R），文库制备试剂盒（TruSeq RNA Sample Prep Kit），测序平台（Illumina HiSeq 2500），读长（100bp，双端） 阅读提示：Methods中'RNA-seq'部分 |
| ChIP-seq | 抗体列表，文库制备试剂盒（Nextera DNA Sample Prep Kit），测序平台（Illumina HiSeq 2500），读长（101bp，双端） 阅读提示：Methods中'ChIP-seq'部分和Table 1 |
| Hi-C | 交联时间（20分钟），限制性内切酶（DpnII），测序平台（Illumina NovaSeq6000），读长（101bp，双端），生物学重复数（2个） 阅读提示：Methods中'In Situ Hi-C'部分 |