冷冻三次：新鲜和玻璃化-升温小鼠胚胎的活力与移植后结局

研究问题：一次、两次或三次玻璃化-升温循环对胚胎活力、着床潜力和移植后发育的影响与新鲜移植相比如何？ 总结答案：重复的玻璃化-升温循环在两次或更多次循环后逐渐损害胚胎冷冻存活、囊胚质量和胎儿生长。 已有认识：冷冻保存在胚胎储存和植入前遗传学检测中至关重要，在等待结果时胚胎被活检并冷冻。然而，由于活检效应、既往着床失败、缺乏真正的非冷冻对照组以及与过度生理性激素暴露混杂的新鲜移植比较，重复玻璃化-升温循环的影响仍不清楚。 研究设计、规模、持续时间：为克服临床研究的限制，本研究使用小鼠作为受控的临床前模型。这样可以精确控制冷冻保存时的胚胎阶段和玻璃化方案，并能与未经玻璃化的（新鲜）对照组直接比较，避免了超生理激素暴露或活检的混杂效应。虽然认识到物种差异，但该模型能够集中评估冷冻保存特异性效应。结局包括升温后存活率、细胞谱系分配，以及胚胎移植后第18.5天的结局（妊娠率和着床率、胎儿和胎盘重量）。在一次、两次或三次冷冻-升温循环后评估升温后存活率（分别为3035、1465和447个囊胚；23个独立实验重复）。在一次、两次或三次冷冻-升温循环后定量内细胞团（ICM）和滋养外胚层（TE）细胞数，并与新鲜（未玻璃化）对照比较（分别为35、36、33和28个囊胚；四个独立实验重复）。在一次、两次或三次冷冻-升温循环后评估移植后结局，并与新鲜（未玻璃化）对照比较（分别为30、33、39和22只假孕受体）。进行了样本量计算以确保研究具有适当的检验效能。 参与者/材料、设置、方法：通过体外受精生成小鼠胚胎并培养至囊胚阶段，并进行零次（新鲜）、一次、两次或三次重复的玻璃化-升温循环。通过形态学评估升温后存活率，并使用OCT-3/4（ICM）和CDX2（TE）的免疫组织化学评估细胞谱系分配。使用胚胎移植进一步评估发育能力，在第18.5天测量妊娠率、着床结局（着床率、可活着床率、吸收率）、胎儿和胎盘结局（胎儿重量、胎盘重量以及胎儿-胎盘重量比）。 主要结果和机会的作用：胚胎冷冻存活率随冷冻-升温循环次数的增加而显著下降，两次或三次循环后与一次循环相比显著降低（P<0.05），三次循环后非存活胚胎比例显著增加（P<0.001）。与新鲜胚胎相比，两次或三次循环后ICM细胞数显著减少（P<0.0001），而两次循环后TE细胞数增加（P<0.05）。与新鲜相比，一次、两次或三次循环后ICM:TE比率显著降低（P<0.01）。胚胎移植后，所有冷冻-升温组的妊娠率均低于新鲜对照组，尽管这些差异无统计学意义。与新鲜移植相比，一次循环后妊娠的相对风险为0.74（95% CI 0.34–1.64），两次循环后为0.75（95% CI 0.35–1.62），三次循环后为0.59（95% CI 0.27–1.32）。着床率和可活着床率显示类似的非显著降低，而两次或三次冷冻-升温循环后吸收率数值升高。与新鲜组相比，两次和三次循环后胎儿重量显著降低（P=0.037和P=0.012），胎盘重量有非显著的增加趋势，胎儿-胎盘重量比在两次和三次循环后显著降低（P=0.009和P=0.002）。虽然冷冻存活率、ICM细胞数和胎儿结局显示出明确的统计学效应，但非显著的妊娠率、着床率和吸收率指标表明，机会可能部分解释了移植后变异性。 大规模数据：不适用。 局限性、注意事项：该研究使用了小鼠模型，尽管操作流程反映了临床实践，但物种差异意味着需要进一步的机制和转化研究来评估与人类生殖的相关性。此外，该研究仅关注囊胚期胚胎，限制了研究结果对其他发育阶段的适用性。未单独研究冷冻保护剂暴露的影响。 研究结果的更广泛意义：这些发现提供了重复胚胎玻璃化-升温累积效应的定量证据，可能有助于优化冷冻保存方案，限制不必要的再冷冻，并支持完善临床指南以改善体外受精中胚胎活力和胎儿结局。 研究资助/利益冲突：K.R.D.由澳大利亚研究委员会未来奖学金（阿德莱德大学，FT240100291）支持。作者声明不存在利益冲突。 试验注册号：不适用。