多组学图谱描绘PI微环境
明确PI组织的细胞组成和空间组织结构。
对8例PI组织进行scRNA-seq，与健康牙龈数据整合，并进行空间转录组分析；通过差异丰度、免疫组化和空间共定位分析表征PI微环境。
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炎症性肌成纤维细胞重编程中性粒细胞命运驱动种植体周围炎的慢性炎症
Inflammatory myofibroblasts reprogram neutrophil fate to drive chronic inflammation in peri-implantitis
实验完整度
高整合单细胞转录组、空间转录组、多种体外功能实验（趋化、凋亡）及大鼠体内模型验证，并进行药物干预。
主要模型
人种植体周围炎组织 健康牙龈组织 大鼠种植体周围炎模型 原代成纤维细胞（HGF/PIF） dHL-60细胞
重点核对
单细胞和空间转录组数据分析（8例PI组织） 中性粒细胞亚群鉴定（CXCR4⁺衰老亚群） CXCR2拮抗剂SB225002体内干预 利索茶碱处理原代成纤维细胞 STAT4在炎症性肌成纤维细胞中的预测调控
摘要
种植体周围炎（PI）是一种多因素慢性炎症性疾病，以持续性黏膜炎症和进行性边缘骨丢失为特征，然而维持慢性炎症的组织结构和细胞程序尚未完全明确。在此，我们整合单细胞和空间转录组分析与靶向验证，绘制了PI微环境及其调控回路。PI病变表现出明显的免疫富集，包括CXCR4⁺衰老中性粒细胞的扩增，其存活信号增强，与细胞凋亡延迟一致。空间和通讯分析揭示了PI特异性的基质-髓系组织，其中成纤维细胞富集区域与髓系热点密切相关，并表现出增强的CXCL和CSF相关信号。在成纤维细胞区室中，炎症性肌成纤维细胞成为CXCL/CSF富集分泌程序中突出的预测来源，其中CXCL6和CSF3被强调为中性粒细胞募集和存活的候选介质。在功能上，阻断CXCR2轴可减少中性粒细胞浸润并减轻种植体周围骨吸收。上游调控分析提名STAT4为炎症性基质程序的候选上游调节因子；使用利索茶碱进行药理学扰动可降低CXCL6/CSF3表达，减弱中性粒细胞趋化性，部分恢复细胞凋亡敏感性，并在体内减轻炎症和骨丢失。总之，这些发现支持一个在PI中维持慢性炎症的基质-中性粒细胞回路，并强调基质炎症程序和中性粒细胞募集/存活通路作为潜在的治疗切入点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 种植体周围炎中维持慢性炎症的组织结构和细胞程序尚不明确，本研究旨在解析其微环境及调控回路。
- 核心机制
- 炎症性肌成纤维细胞通过CXCL/CSF富集分泌程序（包括CXCL6和CSF3）促进中性粒细胞募集和存活，导致CXCR4⁺衰老中性粒细胞扩增和凋亡延迟，从而维持慢性炎症；STAT4被预测为这一炎症基质程序的上游调节因子。
- 主要证据
- 单细胞和空间转录组分析显示PI中成纤维细胞与髓系细胞共定位及CXCL/CSF信号增强；体外实验证明PI成纤维细胞条件培养基可增强dHL-60趋化和抗凋亡表型；大鼠模型中阻断CXCR2或利索茶碱治疗可减轻中性粒细胞浸润和骨吸收。
- 研究意义
- 研究阐明了种植体周围炎中成纤维细胞组织的中性粒细胞趋化和存活信号轴，提示基质-髓系信号节点可作为种植体周围疾病的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定中性粒细胞亚群及凋亡延迟
验证PI中中性粒细胞的成熟状态和凋亡特征。
对中性粒细胞谱系进行再聚类，鉴定三个亚群；通过多重免疫荧光检测MPO、MMP9、MCL1和cleaved caspase-3表达。
体内验证中性粒细胞募集和CXCR2阻断
验证中性粒细胞募集在PI骨吸收中的作用及CXCR2阻断的治疗潜力。
建立大鼠PI模型，通过局部注射CXCR2拮抗剂SB225002，评估骨吸收和组织学改变。
体外验证成纤维细胞对中性粒细胞趋化和存活的影响
验证PI成纤维细胞是否通过分泌因子影响中性粒细胞趋化和凋亡。
收集健康牙龈成纤维细胞（HGF）和PI成纤维细胞（PIF）的条件培养基，用于dHL-60趋化实验、Western blot和凋亡流式检测。
鉴定炎症性肌成纤维细胞和STAT4调控
识别调控中性粒细胞的成纤维细胞亚群及其潜在上游调控因子。
再聚类成纤维细胞谱系，进行拟时间轨迹、SCENIC regulon分析和CellOracle计算机模拟敲除，预测STAT4在炎症性肌成纤维细胞中的作用。
验证利索茶碱对成纤维细胞程序及体内效果
验证抑制STAT4相关程序是否改变成纤维细胞功能并减轻体内炎症和骨丢失。
用利索茶碱处理PIF，检测CXCL6/CSF3表达、条件培养基对dHL-60趋化和凋亡的影响；在大鼠PI模型中评估治疗效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织消化 | IV型胶原酶 | -- | -- |
| 分散酶II | -- | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | -- | -- | |
| 单细胞测序 | 10x Genomics Chromium平台 | 10x Genomics | -- |
| 空间转录组测序 | 10x Visium FFPE平台 | 10x Genomics | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 细胞处理 | 肿瘤坏死因子-α | -- | -- |
| 药物处理 | 利索茶碱 | -- | -- |
| 细胞分化 | 全反式维甲酸（ATRA） | -- | -- |
| 二甲亚砜（DMSO） | -- | -- | |
| 动物模型 | 种植体（SLA表面） | Weigao | -- |
| 组织学 | H&E染色试剂盒 | Solarbio | -- |
| 多重免疫荧光 | TSA信号放大系统 | Servicebio | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| microCT | 显微CT | PINGSENG Healthcare | -- |
| 趋化实验 | Transwell系统（5µm孔径） | -- | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V/PI染色试剂盒 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞RNA测序 | 组织消化酶（胶原酶IV 1 mg/mL, 分散酶II 2 U/mL, DNase I 0.1 mg/mL）及时间（37°C, 30-45 min）；10x Genomics Chromium平台；Cell Ranger v7.0.0；GRCh38-2020-A参考基因组；线粒体转录本>25%去除 阅读提示：Materials and methods: Single-cell RNA sequencing |
| 空间转录组测序 | 10x Visium for FFPE平台；切片厚度4.5 µm；Space Ranger v1.3.1；GRCh38-2020-A参考基因组；cell2location和NMF分析 阅读提示：Materials and methods: Spatial transcriptomics sequencing |
| 原代成纤维细胞培养 | 分离方法（外植体或酶消化）；DMEM+10% FBS+1%青霉素-链霉素；TNF-α处理浓度10 ng/mL；利索茶碱浓度50 μmol/L 阅读提示：Materials and methods: Primary fibroblast culture and conditioned medium preparation |
| 中性粒细胞样细胞分化 | HL-60细胞分化：DMSO (1%) + ATRA (1 μmol/L) 处理5天 阅读提示：Materials and methods: Differentiation of neutrophil-like cells |
| 趋化实验 | Transwell孔径5 µm；dHL-60细胞上室加入；条件培养基下室；孵育90 min 阅读提示：Materials and methods: Chemotaxis assay |
| 凋亡检测 | Annexin V/PI双染；流式细胞术门控策略 阅读提示：Materials and methods: Flow cytometry |
| Western blot | 抗体：STAT4, p-STAT4, caspase-3, MCL1, cIAP2, GAPDH；三次独立生物学重复 阅读提示：Materials and methods: Western blot |
| 大鼠种植体周围炎模型 | 雄性SD大鼠（6周龄）；种植体（Weigao, SLA表面）；骨结合期4周；丝线结扎诱导2周；药物注射间隔每2天 阅读提示：Materials and methods: Peri-implantitis (PI) model |
| MicroCT分析 | microCT型号（PINGSENG Healthcare）；ROI选择；测量指标：BV/TV, BMD, Tb.Th, 垂直距离 阅读提示：Materials and methods: MicroCT analysis |