建立DED小鼠模型并评估角膜损伤
模拟DED并确认角膜上皮损伤的发生。
使用皮下注射氢溴酸东莨菪碱并置于干燥环境中建立DED小鼠模型，通过荧光素染色、SEM和TEM评估角膜上皮损伤。
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RIPK3/SQSTM1介导的坏死性凋亡在干眼病中激活NLRP3炎症小体
RIPK3/SQSTM1-Mediated Necroptosis Activates the NLRP3 Inflammasome in Dry Eye Disease
实验完整度
高包含DED小鼠模型、体外细胞模型、RIPK3/NLRP3敲除、AAV过表达、siRNA敲低、RNA-seq等多层次验证，并明确功能与机制验证
主要模型
DED小鼠模型（氢溴酸东莨菪碱联合干燥应激诱导） RIPK3敲除（RIPK3−/−）小鼠 NLRP3敲除（NLRP3−/−）小鼠 人角膜上皮细胞系HCE-2
重点核对
DED小鼠模型建立：皮下注射氢溴酸东莨菪碱（1.5 mg/0.3 mL）每日三次，连续五天，并置于湿度≤30%且有气流的环境 Nec-1处理：结膜下注射5 µL 0.3 µM Nec-1（PBS配制），每两天一次 RIPK3过表达：结膜下注射5 µL RIPK3特异性GFP-AAV（1.45 × 10^13 vg/mL），DED诱导前一天注射 细胞DS模型：HCECs空气干燥10分钟，随后恢复10分钟、30分钟、1小时、2小时 siRNA转染：使用Lipofectamine RNAiMAX，siRNA终浓度10 µM，5 µL siRNA与9 µL转染试剂混合 统计显著性阈值：P < 0.05
摘要
目的：干眼病（DED）的特征是进行性角膜上皮损伤和慢性炎症，然而上皮丢失背后的具体细胞死亡机制仍不清楚。本研究探讨了RIPK3介导的坏死性凋亡在DED角膜上皮损伤和炎症中的作用。方法：使用氢溴酸东莨菪碱和干燥应激建立DED小鼠模型。通过荧光素染色、SEM和TEM评估角膜损伤。通过RNA测序、京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因集富集分析探索分子机制。使用敲除（RIPK3−/−， NLRP3−/−）、AAV介导的过表达和siRNA敲低验证RIPK3和NLRP3的致病作用。在体内评估了坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1的治疗潜力。结果：RNA测序和KEGG分析确定TNF信号通路和坏死性凋亡标志物（RIPK3、MLKL）在DED角膜上皮中显著上调。RIPK3敲低显著减轻角膜上皮损伤和细胞死亡，而局部RIPK3过表达加重上皮损伤和炎症反应。机制上，SQSTM1作为RIPK3的关键下游介质，促进MLKL激活和坏死性凋亡，独立于经典自噬流。进一步分析表明，RIPK3–SQSTM1轴直接放大NLRP3炎症小体激活，从而将上皮细胞死亡与持续炎症信号联系起来。一致地，干燥应激在人角膜上皮细胞中诱导快速且持续的RIPK3–MLKL激活，而Necrostatin-1在体内保护角膜上皮完整性并抑制炎症小体激活。结论：本研究确定RIPK3–SQSTM1–NLRP3信号轴是DED中角膜上皮损伤和炎症的关键驱动因素。这些发现为眼表上皮丢失提供了机制见解，并强调坏死性凋亡是DED一个有前景的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DED中角膜上皮细胞死亡和炎症的具体分子机制尚不清楚，本研究旨在探究RIPK3介导的坏死性凋亡在DED角膜上皮损伤和炎症中的作用及其下游机制。
- 核心机制
- RIPK3通过上调SQSTM1，以不依赖自噬的方式促进MLKL激活和坏死性凋亡，进而激活NLRP3炎症小体，形成RIPK3–SQSTM1–NLRP3信号轴，驱动角膜上皮损伤和炎症。
- 主要证据
- DED小鼠角膜RNA测序显示TNF信号通路和坏死性凋亡标志物上调；RIPK3敲除减轻角膜缺损和细胞死亡，RIPK3过表达加重损伤；SQSTM1敲低抑制MLKL和NLRP3炎症小体激活；NLRP3敲除减轻角膜损伤；Nec-1治疗抑制坏死性凋亡和炎症并保护角膜。
- 研究意义
- 该研究为DED的病理生理学提供了新的机制见解，并将坏死性凋亡确定为缓解这种广泛且致残性疾病的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组分析筛选关键信号通路
鉴定DED角膜上皮损伤中的关键分子通路和坏死性凋亡相关基因。
对正常和DED小鼠角膜进行RNA测序，通过KEGG富集分析和热图展示TNF信号通路及坏死性凋亡标志物的变化。
验证RIPK3在DED中的作用
验证RIPK3是否作为关键调控因子促进DED中的坏死性凋亡和角膜损伤。
在DED模型中，对比野生型与RIPK3敲除小鼠的角膜荧光素染色、TUNEL、MLKL/p-MLKL表达；并在野生型小鼠中结膜下注射RIPK3过表达AAV，评估角膜损伤和MLKL表达。此外，在HCECs中过表达RIPK3进行转录组分析。
探究SQSTM1在RIPK3介导坏死性凋亡中的作用
确定SQSTM1是否作为RIPK3的下游介质促进坏死性凋亡，并评估其是否依赖自噬。
在HCECs中通过siRNA敲低或过表达SQSTM1，检测MLKL和p-MLKL表达；通过TEM、LysoTracker和LC3/SQSTM1共定位评估自噬流；使用Baf1抑制自噬进一步验证。
转录组分析SQSTM1依赖性变化
通过转录组分析揭示SQSTM1在DS条件下调控的基因和通路。
对siNC、siNC+DS、DS+siSQSTM1以及SQSTM1OE组进行RNA-seq，通过GSEA、Venn图、MSigDB富集和Mfuzz聚类分析。
验证RIPK3-SQSTM1轴对NLRP3炎症小体的调控
验证RIPK3-SQSTM1轴是否激活NLRP3炎症小体并介导炎症反应。
在DED小鼠角膜和HCECs中检测NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β表达；使用NLRP3敲除小鼠评估角膜损伤；在HCECs中过表达RIPK3或SQSTM1、敲低SQSTM1，检测炎症小体成分。
评估Nec-1的体内治疗效果
评估坏死性凋亡抑制剂Nec-1对DED角膜损伤和炎症的缓解作用。
在DED模型小鼠中结膜下注射Nec-1，通过荧光素染色、TEM、TUNEL和免疫荧光检测评估角膜损伤和坏死性凋亡及炎症标志物的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | -- | -- |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 人表皮生长因子 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 动物处理 | Necrostatin-1 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞死亡检测 | TUNEL FITC细胞凋亡检测试剂盒 | Vazyme Biotech | -- |
| 分子检测 | 抗RIPK3抗体 | Cell Signaling Technology | 13526 |
| 抗磷酸化RIPK3抗体 | Cell Signaling Technology | 93654 | |
| 抗MLKL抗体 | Cell Signaling Technology | 14993 | |
| 抗磷酸化MLKL抗体 | Cell Signaling Technology | 37333 | |
| 抗NLRP3抗体 | Cell Signaling Technology | 15101 | |
| 抗SQSTM1抗体 | Cell Signaling Technology | 5114 | |
| 抗Beclin-1抗体 | Cell Signaling Technology | 3495 | |
| 抗ATG16L1抗体 | Cell Signaling Technology | 8098 | |
| 抗LC3B抗体 | Cell Signaling Technology | 83506 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG | Cell Signaling Technology | 7072 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| Alexa Fluor 488标记的驴抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 4412 | |
| Alexa Fluor 488标记的驴抗小鼠IgG | Cell Signaling Technology | 4409 | |
| ASC抗体 | Proteintech | 0500-1-AP | |
| caspase-1抗体 | Proteintech | 22915-1-AP | |
| 电镜样本制备 | 六甲基二硅氮烷 | -- | -- |
| 电镜观察 | JEOL 5600扫描电子显微镜 | JEOL Ltd. | -- |
| 日立HT7700透射电子显微镜 | Hitachi | -- | |
| RNA提取 | RNeasy Plus Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNA测序文库构建 | TruSeq链特异性mRNA文库制备试剂盒 | Illumina | 20020594 |
| 测序 | Illumina PE150测序仪 | Illumina | -- |
| 细胞成像 | 倒置荧光显微镜（DMi8） | Leica | -- |
| 共聚焦成像 | 共聚焦激光扫描显微镜（LSM 980） | Zeiss | -- |
| 角膜评估 | 裂隙灯显微镜成像系统（SL-D7/DC-3/MAGENet） | Topcon | -- |
| 图像分析 | ImageJ软件 | National Institutes of Health | -- |
| 基因过表达 | RIPK3特异性过表达GFP标记的腺相关病毒 | Tsingke Biotechnology | -- |
| 空GFP-AAV | Tsingke Biotechnology | -- | |
| pCDH-copGFP-T2A-Puro载体 | Tsingke Biotechnology | -- | |
| RNA干扰 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | 13778150 |
| Opti-MEM培养基 | -- | -- | |
| 蛋白提取 | Minute总蛋白提取试剂盒 | Invent Biotechnologies | SD001 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Millipore | -- |
| 蛋白印迹 | PVDF膜 | Millipore | -- |
| ECL化学发光试剂盒 | Vazyme Biotech | E411 | |
| Bio-Rad Western blot检测系统 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism软件 | GraphPad | 10.2.3 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| DED小鼠模型 | 小鼠品系、年龄、性别；氢溴酸东莨菪碱剂量、给药频率和途径；环境湿度；气流条件 阅读提示：Materials and Methods: Animal Model and Treatment |
| Nec-1治疗 | Nec-1浓度、注射体积、注射途径、给药频率 阅读提示：Materials and Methods: Animal Model and Treatment |
| RIPK3过表达 | AAV滴度、注射体积、注射途径、注射时间 阅读提示：Materials and Methods: Animal Model and Treatment |
| 细胞DS模型 | 细胞系、空气干燥时间、恢复时间点 阅读提示：Materials and Methods: Cell Culture and DS Model Establishment |
| siRNA敲低 | siRNA序列、浓度、转染试剂用量、转染时间 阅读提示：Materials and Methods: RNA Interference |
| 自噬分析 | Bafilomycin A1浓度、处理时间 阅读提示：Materials and Methods: Cell Culture and DS Model Establishment |