建立活细胞天冬氨酸生物传感器系统
实时检测天冬氨酸水平和细胞增殖，以揭示动态变化。
使用jAspSnFR3和NucRFP双表达系统，通过Incucyte活细胞成像监测GFP:RFP比值和细胞核计数。
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琥珀酸脱氢酶缺失通过琥珀酸介导的天冬氨酸转氨甲酰酶抑制抑制嘧啶生物合成
Succinate dehydrogenase loss suppresses pyrimidine biosynthesis via succinate-mediated inhibition of aspartate transcarbamylase
实验完整度
高包含体外酶活实验、细胞系模型（143B、H1299）、基因敲除模型（GOT1/2 DKO、FH-KO、SDHB-KO）及小鼠肿瘤模型等多层级验证，并进行功能验证和机制研究。
主要模型
143B细胞系 H1299细胞系 GOT1/2双敲除143B和H1299细胞 SDHB敲除143B细胞 FH敲除143B细胞 小鼠垂体瘤模型
重点核对
细胞类型和培养基条件（如DMEM有无丙酮酸） 抑制剂浓度（如AA5 5 μM，rotenone 50 nM，BAY-1895344梯度） 代谢物补充浓度（如uridine 200 μM，adenine 100 μM，asparagine 500 μM） 处理时间点（如24 h、32 h、44 h、72 h） 检测指标（如LC-MS代谢物、细胞周期、增殖率、蛋白磷酸化）
摘要
氨基酸天冬氨酸的可用性降低在不同生物学背景下限制了细胞功能，但天冬氨酸丰度、下游代谢变化和功能效应之间的时间相互作用仍知之甚少。在这里，我们表明琥珀酸脱氢酶（SDH）抑制通过细胞天冬氨酸耗竭和琥珀酸积累的双重效应抑制嘧啶合成。使用天冬氨酸生物传感器和活细胞成像，我们在几种天冬氨酸限制模型中监测天冬氨酸水平和细胞增殖。虽然复合物I抑制或天冬氨酸生物合成酶敲除导致天冬氨酸水平严格降低并损害增殖，但SDH抑制产生独特的天冬氨酸反弹，却未能恢复增殖。机制上，我们发现SDH缺失通过琥珀酸积累损害嘧啶生物合成，琥珀酸竞争性抑制哺乳动物天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase）对天冬氨酸的利用，这是嘧啶生物合成的关键步骤。这种代谢相互作用发生在多种SDH缺陷模型中，导致嘧啶不足、复制应激和对ATR激酶抑制的敏感性。总之，这些发现定义了琥珀酸在调节细胞核苷酸稳态中的意外作用，并展示了级联代谢相互作用如何展开以影响细胞功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SDH抑制如何影响天冬氨酸代谢和细胞增殖？其机制是什么？
- 核心机制
- SDH抑制导致琥珀酸积累，琥珀酸竞争性抑制哺乳动物ATCase，从而损害嘧啶从头合成，引起嘧啶不足、复制应激和ATR通路激活。
- 主要证据
- 通过活细胞成像显示SDH抑制导致天冬氨酸反弹但增殖未恢复；LC-MS显示嘧啶中间产物减少；体外酶活实验证明琥珀酸抑制ATCase；细胞周期和CHK1磷酸化显示复制应激。
- 研究意义
- 揭示了琥珀酸作为代谢物调节嘧啶合成的新功能，并为SDH缺陷肿瘤的治疗提供了潜在靶点（如ATR抑制剂敏感性）。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
比较不同天冬氨酸限制范式的动态
确定不同代谢扰动下天冬氨酸和增殖的时间关系。
用rotenone处理、GOT1/2 DKO天冬氨酸饥饿、AA5处理三种范式，记录天冬氨酸水平和增殖率。
确定SDH抑制对嘧啶合成的影响
验证天冬氨酸反弹与嘧啶合成受损相关。
LC-MS分析嘧啶中间产物，补充尿苷、腺嘌呤、天冬酰胺观察对天冬氨酸动态和增殖的影响。
体外验证琥珀酸抑制ATCase
证明琥珀酸直接抑制ATCase活性。
重组表达MBP-ATCase，进行酶活性实验，测定不同琥珀酸浓度下的初始速率，并计算IC50。
在细胞和体内模型中验证机制
确认琥珀酸在细胞和动物水平抑制嘧啶合成。
使用AA5处理的FH-KO和SDHB-KO细胞，以及RP-SDHB小鼠肿瘤，测量代谢物和ATCase活性指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞计数 | 库尔特计数器Multisizer 4 | Beckman Coulter | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| 药物处理 | Atpenin A5 | MedChemExpress | HY-126653 |
| 鱼藤酮 | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| BAY-1895344 | Selleckchem | S8666 | |
| VE-821 | -- | -- | |
| 代谢物补充 | 天冬氨酸 | Sigma-Aldrich | A7219 |
| 天冬酰胺 | Sigma-Aldrich | A7094 | |
| 尿苷 | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| 腺嘌呤 | Sigma | A2786 | |
| 琥珀酸 | Sigma | S3674 | |
| 次黄嘌呤 | Cayman | 22254 | |
| 鸟嘌呤 | Sigma | G11950 | |
| 蛋白表达与纯化 | HisPur钴树脂 | Thermo | 89964 |
| Superdex 200 16/600 | Cytiva | -- | |
| Q5高保真PCR预混液 | NEB | M0492 | |
| GeneArt Hifi Gibson组装预混液 | Invitrogen | A46627 | |
| 酶活测定 | 安替比林 | Sigma | A5882 |
| 丁二酮一肟 | Sigma | 31550 | |
| 无脂肪酸牛血清白蛋白组分V | Roche | 03117057001 | |
| 质谱光度测定 | TwoMP仪器 | Refeyn | -- |
| MassFerence P1校准物 | Refeyn | MP-CON-41033 | |
| LC-MS | Q Exactive HF-X混合四极杆-Orbitrap质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| Vanquish Flex二元超高效液相色谱系统 | Thermo Scientific | -- | |
| SeQuant ZIC-pHILIC聚合物色谱柱 | EMD Millipore | -- | |
| Agilent 6495D三重四极杆质谱仪 | Agilent Technologies | -- | |
| Poroshell 120 HILIC-Z色谱柱 | Agilent Technologies | -- | |
| 流式细胞术 | BD FACSymphony A52细胞分析仪 | BD | -- |
| 碘化丙啶 | Biotium | 40017 | |
| 核糖核酸酶A | QIAGEN | -- | |
| 核转染 | 4D核转染仪 | Amaxa, Lonza | -- |
| SF缓冲液 | Lonza | V4XC-2032 | |
| sNLS-spCas9蛋白 | Aldevron | 9212 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | A33250 |
| 内标 | U-13C螺旋藻 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-8400-PK |
| 同位素示踪 | 谷氨酰胺酰胺-15N | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-557-PK |
| 谷氨酰胺α-15N | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-1016-PK | |
| U-13C谷氨酰胺 | Cambridge Isotopes | CLM-1822 | |
| 蛋白合成检测 | 嘌呤霉素 | Sigma | P9620 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Sigma | R0278 |
| 蛋白酶抑制剂 | Fisher | A32953 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Fisher | 78442 | |
| Bolt 4x上样缓冲液 | Thermo Fisher | B0007 | |
| Bolt 10x还原剂 | Thermo Fisher | B0004 | |
| iBlot2转印叠 | Fisher | IB23001 | |
| GOT2抗体 | Proteintech | 14800-1-AP | |
| GOT1抗体 | Cell Signalling | 34423S | |
| GFP抗体 | Sigma | 11814460001 | |
| FH抗体 | Origene | TA500675S | |
| SDHB抗体 | Atlas | HPA002868 | |
| 磷酸化Chk1抗体 | Cell Signalling | 2348S | |
| Chk1抗体 | Cell Signalling | 2G1D5 | |
| 磷酸化Chk2抗体 | Cell Signalling | 2197S | |
| GAPDH抗体 | Cell Signalling | 5174S | |
| Vinculin抗体 | Sigma | SAB4200729 | |
| 微管蛋白抗体 | Sigma | T6199 | |
| 800CW山羊抗小鼠IgG | LiCOR | 926-32210 | |
| 680RD山羊抗兔IgG | LiCOR | 926-68071 | |
| Odyssey近红外成像系统 | LiCOR | -- | |
| 蛋白质印迹 | 嘌呤霉素抗体 | Kerafast | Kf-Ab02366-1.1 |
| 细胞培养 | 潮霉素 | Sigma-Aldrich | H7772-1G |
| 聚凝胺 | Sigma | TR-1003-G | |
| 嘌呤霉素 | Sigma | P9620 | |
| FuGENE转染试剂 | Fisher | PRE2693 | |
| 分子克隆 | p-Lenti-jAspSnFR3质粒 | Addgene | 203488 |
| pMDLg/pRRE质粒 | Addgene | 12251 | |
| pRSV-Rev质粒 | Addgene | 12253 | |
| pMD2.G质粒 | Addgene | 12259 | |
| pLenti-NucRFP质粒 | Cellomics | PLV-10205-50 | |
| 细胞培养 | 支原体检测试剂盒 | R&D Systems | -- |
| 24孔板 | Nunc | 142475 | |
| 24孔板 | Corning | 3516 | |
| 12孔板 | Corning | 3513 | |
| 6孔板 | Corning | -- | |
| 0.45微米滤膜 | Fisher | 9720514 | |
| 0.22微米过滤器 | Fisher | FB12566506 | |
| 代谢物提取 | 高效液相色谱级甲醇 | -- | -- |
| 血库盐水 | Fisher | 23293184 | |
| 氯仿 | -- | -- | |
| 异丙醇 | Thermo Fisher | A464SK | |
| 乙酸钠 | Sigma | S7545 | |
| 细胞裂解 | 溶菌酶 | Thermo | 89833 |
| 辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷 | CHEM-IMPEX | 21810 | |
| β-巯基乙醇 | Sigma | M3148 | |
| 苯zonase核酸酶 | -- | -- | |
| 氯化镁 | -- | -- | |
| 氯化钙 | -- | -- | |
| 蛋白纯化 | 三(2-羧乙基)膦 | Sigma | 646547 |
| 咪唑 | -- | -- | |
| 氯化钠 | -- | -- | |
| 甘油 | -- | -- | |
| Amicon离心过滤器 | Millipore | UFC901024 | |
| HisPur钴树脂 | Thermo | 89964 | |
| 质谱 | LTQ Velos ESI校准液 | Pierce | -- |
| 分子对接 | AutoDock Vina v.1.2.7 | -- | -- |
| ChimeraX v.1.10.1 | -- | -- | |
| 数据处理 | Tracefinder v.4.1 | Thermo Scientific | -- |
| MassHunter定量分析软件 | Agilent Technologies | -- | |
| 数据分析 | FlowJo v.10.10.1 | -- | -- |
| ImageJ2 v.2.9.0 | -- | -- | |
| GraphPad Prism v.10.4.1 | -- | -- | |
| 动物实验 | 他莫昔芬 | -- | -- |
| 玉米油 | -- | -- | |
| 活细胞成像 | Incucyte S3 | Sartorius | 4647 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 活细胞成像 | 细胞类型、培养基（有无丙酮酸）、处理药物及浓度（如AA5 5 μM）、细胞接种密度 阅读提示：Methods: jAspSnFR3和NucRFP Incucyte测量；图例说明 |
| 代谢物检测 | LC-MS方法、细胞处理时间、代谢物提取和标准化方法 阅读提示：Methods: 极性代谢物提取和LC-MS部分 |
| 酶活测定 | ATCase构建、纯化方法、反应条件（底物浓度、反应时间） 阅读提示：Methods: ATCase表达纯化和活性测定 |
| 细胞周期分析 | 处理时间、碘化丙啶染色、流式细胞仪设置 阅读提示：Methods: 细胞周期分析 |
| 动物模型 | 基因型、他莫昔芬诱导方案、肿瘤收集时间 阅读提示：Methods: 动物研究部分 |