嗜酸性粒细胞是控制胸腺再生的2型免疫轴的关键要素

Eosinophils are an essential element of a type 2 immune axis that controls thymus regeneration

作者信息Emilie J Cosway, Andrea J White, Sonia M Parnell, Edina Schweighoffer, Helen E Jolin, Andrea Bacon, Hans-Reimer Rodewald, Victor Tybulewicz, Andrew N J McKenzie, William E Jenkinson, Graham Anderson

PMID35275754

期刊Sci Immunol

发布时间2022-03-11

DOI10.1126/sciimmunol.abn3286

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实验完整度

高

包含基因敲除小鼠模型（ΔdblGATA、Il4ra-/-、Cd1d-/-等）的功能验证、细胞转移实验、体内细胞因子给药、胎鼠胸腺器官培养及多参数流式分析，具有多个独立证据层级。

主要模型

BALB/c小鼠亚致死照射模型 B6小鼠亚致死照射模型 ΔdblGATA嗜酸性粒细胞缺陷小鼠 Ccr3-/-小鼠

重点核对

亚致死照射剂量：BALB/c为4.25Gy，C57BL/6为5.0Gy 嗜酸性粒细胞缺陷模型：ΔdblGATA小鼠 CCR3拮抗剂SB328437处理浓度10mM 重组IL4和IL5给药方案：-3、-2、-1、+1天腹腔注射40ng

摘要

用于癌症治疗的治疗性干预会损害胸腺并限制保护性免疫的恢复。在这里，我们表明嗜酸性粒细胞是胸腺内2型免疫网络的重要组成部分，该网络使胸腺在消融治疗后能够恢复。在损伤后的数小时内，胸腺通过CCR3依赖的方式被外周嗜酸性粒细胞定植，这重新建立了控制胸腺生成的上皮微环境。嗜酸性粒细胞对胸腺再生的调节通过NKT细胞和ILC2的协同作用发生，NKT细胞通过IL4受体信号触发胸腺基质中CCL11的产生，而ILC2代表IL5的胸腺内来源，IL5是一种在损伤后治疗性促进胸腺再生的细胞因子。总的来说，我们的发现确定了一个由多种先天免疫细胞组成的胸腺内网络，该网络在适应性免疫系统重建期间恢复胸腺功能。

建立胸腺损伤模型

诱导胸腺损伤并观察恢复过程

对成年WT小鼠进行全身亚致死照射（SLI），观察胸腺细胞总数减少及后续恢复。

检测损伤后胸腺内嗜酸性粒细胞变化

评估嗜酸性粒细胞是否在胸腺损伤后富集

通过流式细胞术检测胸腺内CD11b+Siglec-F+嗜酸性粒细胞比例和数量。

验证嗜酸性粒细胞功能

确定嗜酸性粒细胞是否必要

比较WT和ΔdblGATA小鼠在SLI后的胸腺恢复，包括重量、细胞数、TEC和胸腺细胞亚群。

研究嗜酸性粒细胞募集机制

确定CCR3和IL4Rα的作用

使用Ccr3-/-小鼠、CCR3拮抗剂和细胞转移实验，以及Il4ra-/-小鼠进行机制分析。

验证iNKT细胞的作用

确定iNKT细胞是否通过IL4/IL13促进胸腺再生

使用IL4GFP和IL13GFP报告小鼠检测iNKT细胞产生细胞因子，并比较WT和Cd1d-/-小鼠的胸腺恢复。

验证ILC2和IL5的作用

确定ILC2是否通过IL5维持嗜酸性粒细胞并促进再生

使用Rag2GFP/IL5tdTomato报告小鼠识别ILC2，并比较ILC2缺陷小鼠（Il7raCreRorafl/fl）与对照的再生情况。

评估IL4和IL5治疗潜力

确定外源性细胞因子是否能增强胸腺再生

对SLI处理的小鼠给予重组IL4或IL5，评估胸腺细胞数、TEC和胸腺细胞亚群。

实验环节	名称	品牌	货号
细胞培养	胶原酶D	Roche	--
脱氧核糖核酸酶I	Roche	--
Liberase TM	Roche	--
胶原酶VIII	Sigma	--
胶原酶分散酶	Roche	--
2-脱氧鸟苷	Sigma	--
干细胞因子	PeproTech	--
FLT3配体	PeproTech	--
重组小鼠IL5	R&D Systems	--
细胞示踪紫	Invitrogen	--
药物处理	CCR3拮抗剂SB328437	R&D Systems	--
重组IL4	PeproTech	--
重组IL5	PeproTech	--
流式分析	抗CD45抗体（30-F11）	eBioscience	--
抗TCRβ抗体（H57-597）	eBioscience	--
抗CD11b抗体（M1/70）	Biolegend	--
抗Siglec-F抗体（ES22-10D8）	Miltenyi Biotech	--
抗CD4抗体（RM4-5）	Biolegend	--
抗CD8α抗体（53-6.7）	Biolegend	--
抗TER119抗体（TER-119）	Biolegend	--
抗CCR3抗体（J073E5）	Biolegend	--
抗CD69抗体（H1.2F3）	eBioscience	--
抗CD62L抗体（MEL-14）	eBioscience	--
PBS57/mCD1d四聚体	NIH Tetramer Core Facility	--
抗IL7Rα抗体（A7P34）	eBioscience	--
抗KLRG1抗体（2F1/KLRG1）	Biolegend	--
抗CD3ε抗体（145-2C11）	eBioscience	--
抗CD5抗体（53-7.3）	eBioscience	--
抗CD11c抗体（N418）	Invitrogen	--
抗B220抗体（RA3-6B2）	Invitrogen	--
抗NK1.1抗体（PK136）	Invitrogen	--
抗EpCAM1抗体（G8.8）	eBioscience	--
UEA1	Vector Labs	--
链霉亲和素	eBioscience	--
抗Ly51抗体（BP-1）	BD Pharmingen	--
抗MHC-II抗体（M5/114.15.2）	eBioscience	--
抗CD80抗体（16-10A1）	Biolegend	--
gp38抗体（8.1.1）	eBioscience	--
CD31抗体（ebio390/390）	eBioscience	--
Foxp3/转录因子染色缓冲液套装	eBioscience	--
山羊抗CCL11抗体（AF-420-NA）	R&D Systems	--
鸡抗山羊Alexa Fluor 488 IgG	Invitrogen	AF21467
DCLK1抗体（DCLKL1）	AbCam	--
驴抗兔647抗体	Invitrogen	A21443
凋亡检测	Annexin V/PI试剂盒	Invitrogen	--
qPCR	μMacs一步法cDNA试剂盒	Miltenyi Biotec	--
SensiMix SYBR No ROX试剂盒	Meridian Bioscience	--
Actb引物检测	Qiagen	QT00095242
Ccl11引物	Sigma-Merck	--
仪器	BD Fortessa流式细胞仪	BD	--
BD Aria分选仪	BD	--
Corbett Rotor Gene-3000 PCR仪	Qiagen	--

实验环节

名称

品牌

货号

细胞培养

Roche

Roche

Roche

Sigma

Roche

Sigma

PeproTech

PeproTech

R&D Systems

Invitrogen

药物处理

CCR3拮抗剂SB328437

R&D Systems

重组IL4

PeproTech

重组IL5

PeproTech

流式分析

抗CD45抗体（30-F11）

eBioscience

抗TCRβ抗体（H57-597）

eBioscience

抗CD11b抗体（M1/70）

Biolegend

抗Siglec-F抗体（ES22-10D8）

Miltenyi Biotech

Biolegend

Biolegend

Biolegend

Biolegend

eBioscience

eBioscience

NIH Tetramer Core Facility

eBioscience

Biolegend

eBioscience

eBioscience

Invitrogen

Invitrogen

Invitrogen

eBioscience

Vector Labs

eBioscience

BD Pharmingen

抗MHC-II抗体（M5/114.15.2）

eBioscience

Biolegend

eBioscience

eBioscience

eBioscience

山羊抗CCL11抗体（AF-420-NA）

R&D Systems

鸡抗山羊Alexa Fluor 488 IgG

Invitrogen

AF21467

DCLK1抗体（DCLKL1）

AbCam

驴抗兔647抗体

Invitrogen

A21443

凋亡检测

Annexin V/PI试剂盒

Invitrogen

qPCR

μMacs一步法cDNA试剂盒

Miltenyi Biotec

SensiMix SYBR No ROX试剂盒

Meridian Bioscience

Actb引物检测

Qiagen

QT00095242

Ccl11引物

Sigma-Merck

仪器

BD Fortessa流式细胞仪

BD Aria分选仪

Corbett Rotor Gene-3000 PCR仪

Qiagen

环节	核对要点
胸腺损伤模型	SLI剂量：BALB/c 4.25Gy，C57BL/6 5.0Gy；小鼠周龄和性别；照射前用Baytril处理一周阅读提示：Materials and Methods: Sub-Lethal Irradiation (SLI)
嗜酸性粒细胞分析	组织消化酶组合：胸腺和脾脏用胶原酶D和DNase-I，肺用Liberase TM，小肠用胶原酶VIII；抗体克隆号阅读提示：Materials and Methods: Flow Cytometry and Cell Sorting
细胞转移实验	供体骨髓细胞培养条件：SCF和FLT3L浓度，IL5浓度，培养天数；CTV标记浓度；CCR3拮抗剂预处理浓度和时间；转移细胞数和时间阅读提示：Materials and Methods: Eosinophil Cultures and Cell Transfer
细胞因子给药	重组IL4或IL5剂量（40ng/次）；给药时间点（-3、-2、-1、+1天）；给药途径（腹腔注射）阅读提示：Materials and Methods: Recombinant IL5 / Recombinant IL4 Injections
胎鼠胸腺器官培养	E15胎鼠；2-dGuo浓度（1.35mM）；培养时间（5-7天）；刺激细胞因子浓度（100μg/ml IL4和IL13）；培养时间（4天）阅读提示：Materials and Methods: Fetal Thymus Organ Culture

环节

核对要点

胸腺损伤模型

SLI剂量：BALB/c 4.25Gy，C57BL/6 5.0Gy；小鼠周龄和性别；照射前用Baytril处理一周

阅读提示：Materials and Methods: Sub-Lethal Irradiation (SLI)

嗜酸性粒细胞分析

组织消化酶组合：胸腺和脾脏用胶原酶D和DNase-I，肺用Liberase TM，小肠用胶原酶VIII；抗体克隆号

阅读提示：Materials and Methods: Flow Cytometry and Cell Sorting

细胞转移实验

供体骨髓细胞培养条件：SCF和FLT3L浓度，IL5浓度，培养天数；CTV标记浓度；CCR3拮抗剂预处理浓度和时间；转移细胞数和时间

阅读提示：Materials and Methods: Eosinophil Cultures and Cell Transfer

细胞因子给药

重组IL4或IL5剂量（40ng/次）；给药时间点（-3、-2、-1、+1天）；给药途径（腹腔注射）

阅读提示：Materials and Methods: Recombinant IL5 / Recombinant IL4 Injections

胎鼠胸腺器官培养

E15胎鼠；2-dGuo浓度（1.35mM）；培养时间（5-7天）；刺激细胞因子浓度（100μg/ml IL4和IL13）；培养时间（4天）

阅读提示：Materials and Methods: Fetal Thymus Organ Culture

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