高通量筛选戈谢病和帕金森病中错误折叠葡萄糖脑苷脂酶的小分子稳定剂

葡萄糖脑苷脂酶（GCase）与一种罕见的单基因疾病（戈谢病，GD）和一种常见的多因素疾病（帕金森病，PD）均有关联，因此是一个紧迫的治疗靶点。为了识别能够纠正由致病性L444P变异GCase所表现出的严重蛋白质错误折叠和运输障碍的化合物，我们开发了一套定量的、基于细胞的高通量分析方法。首先，我们使用一种小的前发光HiBiT肽报告标签对GCase进行标记，从而能够在细胞中定量测定蛋白质的稳定性，同时忠实保持靶点的生物学特性。基于TALEN的基因编辑技术允许将单个HiBiT-GBA1转基因稳定整合到GBA1敲除的H4（神经胶质瘤）细胞的一个基因内安全港位点。该GD细胞模型适用于通过基于滴定的定量高通量筛选进行先导化合物发现，以及通过构效关系进行先导化合物优化。对NCATS生物活性化合物库中10,779种化合物进行的一级筛选，鉴定出140种HiBiT-GCase-L444P稳定剂，包括药理伴侣（ambroxol和非抑制性伴侣NCGC326）和蛋白质稳态调节剂（panobinostat、trans-ISRIB和pladienolide B）。我们部署了两种互补的基于高内涵成像的分析方法来对命中化合物进行分级：荧光淬灭底物LysoFix-GBA捕获了功能性溶酶体GCase活性，而采用抗体hGCase-1/23的免疫荧光分析法则直接可视化了GCase的溶酶体易位。NCGC326在两种二级分析中均表现出活性，并能完全逆转病理性的葡萄糖鞘氨醇积累。最后，我们通过证明NCGC326与蛋白质稳态调节剂在提高GCase-L444P水平方面具有协同作用，验证了联合治疗的概念。展望未来，这些生理相关的分析方法可以促进针对GCase的小分子的鉴定、药理学验证和药物化学优化，最终为GD和PD带来可行的疗法。