全基因组CRISPR筛选鉴定关键基因和通路
鉴定α-鹅膏蕈碱诱导细胞死亡所必需的基因和通路
使用Brunello文库在HAP1细胞中进行全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选，用1.5 μM AMA处理7天后对存活细胞进行深度测序，MAGeCK分析鉴定显著富集基因。
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鉴定吲哚菁绿为对抗蘑菇α-鹅膏蕈碱细胞毒性的STT3B抑制剂
Identification of indocyanine green as a STT3B inhibitor against mushroom α-amanitin cytotoxicity
实验完整度
高包含多层级证据：全基因组CRISPR筛选、细胞与类器官模型功能验证、分子对接、体内小鼠模型生存及病理学验证。
主要模型
HAP1细胞 HepG2细胞 小鼠肝脏类器官 CD-1小鼠（雄性）
重点核对
CRISPR筛选使用HAP1细胞系，Brunello文库（77,441 sgRNA），AMA浓度1.5 μM，处理7天 STT3B敲除验证使用HAP1和HepG2细胞系，分析细胞存活和AMA摄入 ICG处理浓度：细胞实验10 μM（HAP1）和100 μM（HepG2），小鼠实验5 mg/kg静脉注射 小鼠模型：CD-1雄性小鼠，AMA剂量0.33 mg/kg腹腔注射，ICG在4、6、8小时静脉注射 ER-LucT报告系统用于检测STT3B活性
摘要
“死亡帽”毒蘑菇（Amanita phalloides）是世界上最毒的蘑菇，导致90%的蘑菇相关死亡事件。死亡帽最致命的成分是α-鹅膏蕈碱。尽管其具有致命作用，α-鹅膏蕈碱如何毒害人类的确切机制仍不清楚，导致没有特异性解毒剂可用于治疗。在这里，我们表明STT3B是α-鹅膏蕈碱毒性所必需的，其抑制剂吲哚菁绿（ICG）可作为特异性解毒剂。通过将全基因组CRISPR筛选与计算机药物筛选和体内功能验证相结合，我们发现N-聚糖生物合成途径及其关键组分STT3B在α-鹅膏蕈碱毒性中发挥重要作用，并且ICG是一种STT3B抑制剂。此外，我们证明ICG能有效阻断α-鹅膏蕈碱在细胞、肝脏类器官和雄性小鼠中的毒性作用，从而总体提高动物存活率。总之，通过将全基因组CRISPR筛选，结合计算机药物筛选和体内功能验证，我们的研究强调ICG是一种对抗蘑菇毒素的STT3B抑制剂。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- α-鹅膏蕈碱毒性的分子机制是什么，以及能否找到特异性解毒剂？
- 核心机制
- STT3B依赖的N-聚糖生物合成途径是α-鹅膏蕈碱毒性所必需的，ICG通过抑制STT3B活性阻断α-鹅膏蕈碱进入细胞，从而发挥解毒作用。
- 主要证据
- 全基因组CRISPR筛选鉴定STT3B，敲除或敲低STT3B降低α-鹅膏蕈碱毒性，ICG在细胞、肝脏类器官和雄性小鼠中有效阻断α-鹅膏蕈碱诱导的死亡和损伤，并提高小鼠存活率。
- 研究意义
- 该研究提出了一种结合全基因组CRISPR筛选和计算机药物预测的系统框架，可快速发现新的毒素解毒剂，并鉴定ICG作为治疗α-鹅膏蕈碱/死亡帽中毒的潜在药物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证N-聚糖生物合成和STT3B的作用
验证N-聚糖生物合成通路及STT3B在α-鹅膏蕈碱毒性中的必要性
使用KIF（MAN1抑制剂）药理学验证，并利用CRISPR-Cas9敲除HAP1和HepG2中的STT3B，检测细胞存活和AMA摄入。
计算机筛选FDA批准药物
寻找STT3B的潜在抑制剂
对ZINC和Drugbank库共3201个FDA批准化合物进行分子对接筛选，与STT3B的两个结合口袋对接，通过NNScore2评分，最终验证24种化合物的细胞保护效果。
细胞水平验证ICG作用
验证ICG对α-鹅膏蕈碱细胞毒性的保护作用
在HAP1和HepG2细胞中，检测ICG预处理和后处理的细胞存活率，并用Calcein/PI染色确认。
肝脏类器官验证
在更复杂的模型中评估ICG的保护效应
建立小鼠肝脏类器官，用AMA和ICG处理，观察类器官大小、Calcein/PI染色和H&E染色。
机制验证：ICG抑制STT3B活性
证明ICG通过抑制STT3B活性发挥保护作用
检测ICG在细胞内的定位，并利用ER-LucT报告系统检测STT3B活性。
动物水平验证
评估ICG在体内对α-鹅膏蕈碱毒性的解毒效果
CD-1雄性小鼠腹腔注射AMA，4小时后静脉注射ICG（重复三次），检测生化指标、组织病理学和存活率。
体内糖基化分析
验证ICG在体内抑制蛋白糖基化
用SNA和PHA-L凝集素染色检测肝脏切片的糖基化水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| CRISPR筛选 | Brunello文库 | Addgene | 73179 |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| 细胞培养 | Iscove改良Dulbecco培养基 | Gibco | -- |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清（FBS） | NEWZERUM | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Hyclone | -- | |
| 细胞活力测定 | 细胞计数试剂盒-8（CCK8） | APExBIO | K1018 |
| 药物处理 | KIF（甘露糖苷酶I抑制剂） | Macklin | K919109 |
| NGI-1（寡糖转移酶抑制剂） | Macklin | N873007 | |
| 吲哚菁绿（ICG） | Dandong Pharmaceutical Company | H20055881 | |
| 细胞活力测定 | 钙黄绿素/PI细胞活力检测试剂盒 | Beyotime | C2015M |
| 微孔板分光光度计 | BioTek | -- | |
| 荧光显微镜 | 荧光显微镜 | Nikon | -- |
| 细胞转染 | Lipo8000转染试剂 | Beyotime | C0533 |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | 31985070 | |
| 病毒生产 | 0.45 μm超低蛋白结合滤膜 | Merck Millipore | -- |
| 基因分型 | 嘌呤霉素 | Solarbio | P8230 |
| CRISPR筛选 | α-鹅膏蕈碱（AMA） | APExBIO | A4548 |
| 基因组DNA提取 | TIANamp基因组DNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP304 |
| PCR扩增 | 高保真2X PCR预混液 | NEB | M0541L |
| RNA提取 | RNA快速纯化试剂盒 | YIBIN | RN001 |
| cDNA合成 | PrimeScript逆转录预混液 | Takara | RR037A |
| qPCR | TB绿色荧光染料 | Takara | RR820A |
| LightCycler96实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| HPLC | 岛津LC-20AT高效液相色谱仪 | SHIMADZU | -- |
| 液相色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm） | Phenomenex | -- | |
| 0.22 μm滤膜 | Merck Millipore | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Fdbio | FD009 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0010 | |
| 5×上样缓冲液 | Fdbio | FD006 | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| ChemiDoc成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 增强化学发光底物 | Fdbio | FD8000 | |
| OATP1B3抗体 | Proteintech | 66381-1-Ig | |
| GRP78抗体 | Proteintech | 66574-1-Ig | |
| IRE1抗体 | Proteintech | 27528-1-AP | |
| GM130抗体 | Proteintech | 66662-1-Ig | |
| ARF4抗体 | Proteintech | 11673-1-AP | |
| NTCP抗体 | Abbkine | ABP53103 | |
| β-微管蛋白抗体 | Fdbio | FD0064 | |
| 山羊抗小鼠IgG（H+L）HRP | Bioworld | BS12478 | |
| 山羊抗兔IgG（H+L）HRP | Bioworld | BS13278 | |
| 计算机筛选 | OpenBabel软件包 | -- | -- |
| AutoDock工具 | -- | -- | |
| Smina（AutoDock Vina分支） | -- | -- | |
| PyMol | -- | -- | |
| 类器官培养 | I型胶原酶 | -- | -- |
| 透明质酸酶 | -- | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | -- | -- | |
| DMEM/F12培养基 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 两性霉素B | -- | -- | |
| 庆大霉素 | -- | -- | |
| 表皮生长因子 | -- | -- | |
| 氢化可的松 | -- | -- | |
| Y-27632 | -- | -- | |
| 细胞内定位 | ER-tracker绿色荧光探针 | Beyotime | C1042S |
| DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚） | -- | -- | |
| 荧光素酶报告 | pcDNA3.1(+)载体 | Kidan Bio Co. Ltd | -- |
| 萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Beyotime | RG005 | |
| Luminescence Quick Read（发光检测仪） | Promega | -- | |
| 体内成像 | 小动物活体成像系统 | PerkinElmer | -- |
| 凝集素染色 | 荧光素标记的接骨木凝集素（SNA） | Vector Laboratories | FL-1301-2 |
| 荧光素标记的菜豆白细胞凝集素（PHA-L） | Vector Laboratories | FL-1111-2 | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 9 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR筛选 | HAP1细胞来源、Brunello文库转导MOI、puromycin筛选浓度和时间、AMA处理浓度和时间 阅读提示：见Methods“Cell transduction using the Brunello library”和“HAP1 cells AMA resistance screen” |
| 细胞培养与药物处理 | 细胞培养基和补充剂、细胞接种密度、药物处理浓度、孵育时间、细胞活力测定方法 阅读提示：见Methods“Cell lines and cell culture”和“Cell viability assay” |
| STT3B敲除和敲低 | sgRNA序列、载体构建、转染或转导方法、筛选标记、敲除效率验证 阅读提示：见Methods“Establishment of knockout cell lines”和补充方法 |
| HPLC测定AMA摄入 | 细胞数量、AMA处理时间、样品制备方法、色谱条件（流动相、流速、温度） 阅读提示：见Methods“High-performance liquid chromatography (HPLC)” |
| 计算机药物筛选 | 化合物库来源、STT3B结构PDB ID、对接网格参数、评分函数 阅读提示：见Methods“In silico screen of FDA-approved drugs” |
| 细胞功能验证 | ICG预处理和后处理浓度、AMA浓度、孵育时间、细胞活力检测方法 阅读提示：见Results“ICG alleviates AMA toxicity in cells”和Figure legends |
| 类器官实验 | 小鼠品系、肝脏消化条件、类器官培养基成分、AMA和ICG浓度、处理时间 阅读提示：见Methods“Organoids culture”和Figure 5 legends |
| 动物实验 | 小鼠品系、性别、年龄、体重、AMA剂量和给药途径、ICG剂量和给药途径、时间点、检测终点 阅读提示：见Methods“Short-term mouse study (24 h)”和“Long-term mouse study (30 days)”，及Figure 7 legends |
| ER-LucT报告实验 | 质粒构建、转染方法、ICG浓度、报告基因检测方法 阅读提示：见Methods“Luciferase reporter assay” |
| 体内糖基化分析 | 小鼠处理方案、肝脏切片制备、凝集素浓度和孵育时间 阅读提示：见Methods“Lectin staining”和Figure 8 legends |
| 统计分析 | 统计方法、重复数、显著性水平 阅读提示：见Methods“Statistics and reproducibility” |