开发并表征G9a抑制剂RK-701
获得高选择性、低毒性的G9a/GLP抑制剂
通过高通量筛选和结构优化得到RK-701，测定其对G9a和GLP的IC50值，并通过SPR、晶体结构、选择性、细胞渗透性、急性和基因毒性实验表征。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
一种特异性G9a抑制剂揭示BGLT3长链非编码RNA作为化学诱导胎儿珠蛋白基因表达的通用介导因子
A specific G9a inhibitor unveils BGLT3 lncRNA as a universal mediator of chemically induced fetal globin gene expression
实验完整度
高包含体外细胞实验（HUDEP-2、CD34+细胞）、体内小鼠模型、分子机制研究（ChIP-seq、ChIP-qPCR、RNA-seq、基因敲除/敲低）等多层次验证，符合高完整度标准。
主要模型
HUDEP-2细胞系 原代人CD34+造血细胞 C57BL/6小鼠 HiDEP-1细胞系
重点核对
RK-701剂量（HUDEP-2细胞0-1μM处理4天）及γ-珠蛋白、BGLT3表达检测 BGLT3敲低对RK-701和羟基脲诱导γ-珠蛋白的影响 BCL11A和ZBTB7A敲除对BGLT3和γ-珠蛋白表达的影响 G9a抑制对BGLT3位点H3K9me2水平及BCL11A/ZBTB7A占位的影响 体内实验小鼠给药方案（20或50mg/kg，腹腔注射）及胚胎εy-珠蛋白变化
摘要
镰状细胞病（SCD）是一种由β-珠蛋白基因突变引起的遗传性疾病。诱导胎儿γ-珠蛋白是既定的治疗策略。最近，包括G9a抑制剂在内的表观遗传调节剂被提议作为治疗药物。然而，这些小分子重新激活γ-珠蛋白的分子机制仍不清楚。在此，我们报告了一种高选择性和非基因毒性的G9a抑制剂RK-701的开发。RK-701处理在人红细胞细胞和小鼠中均诱导胎儿珠蛋白表达。利用RK-701，我们发现BGLT3长链非编码RNA在γ-珠蛋白诱导中发挥重要作用。RK-701通过抑制与G9a复合的两个主要γ-珠蛋白抑制因子通过CHD4（NuRD复合物的一个组件）在BGLT3基因位点的招募，选择性上调BGLT3。值得注意的是，BGLT3对于不仅RK-701而且羟基脲和其他诱导剂诱导γ-珠蛋白是不可或缺的。BGLT3在γ-珠蛋白诱导中的普遍作用表明其在SCD治疗中的重要性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- G9a抑制剂如何重新激活胎儿珠蛋白基因表达？
- 核心机制
- G9a通过与BCL11A和ZBTB7A形成复合物在BGLT3基因位点催化H3K9me2，并通过CHD4招募抑制因子；RK-701抑制G9a活性，降低H3K9me2，导致抑制复合物解离，从而上调BGLT3表达，进而诱导γ-珠蛋白。
- 主要证据
- 在HUDEP-2细胞和CD34+细胞中，RK-701上调BGLT3和γ-珠蛋白；BGLT3敲低消除RK-701和羟基脲诱导的γ-珠蛋白；BCL11A或ZBTB7A敲除降低BGLT3位点H3K9me2并阻碍RK-701的作用；CHD4作为H3K9me2阅读器介导抑制因子招募。
- 研究意义
- BGLT3 lncRNA是化学诱导胎儿珠蛋白再激活的通用调控因子，为镰状细胞病的治疗提供了新的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证RK-701诱导胎儿珠蛋白表达
评估RK-701对γ-珠蛋白和胎儿血红蛋白的诱导作用
在HUDEP-2细胞和原代CD34+细胞中检测γ-珠蛋白mRNA、HbF蛋白和HbF阳性细胞比例；在小鼠中检测胚胎εy-珠蛋白表达和H3K9me2水平。
证明BGLT3在γ-珠蛋白诱导中的必需作用
确定G9a抑制诱导γ-珠蛋白是否依赖于BGLT3 lncRNA
通过RNA-seq和RT-qPCR检测RK-701处理后BGLT3表达变化；通过shRNA敲低BGLT3后检测γ-珠蛋白表达；在BCL11A/ZBTB7A敲除细胞中敲低BGLT3检测γ-珠蛋白变化。
解析G9a抑制调控BGLT3的分子机制
阐明G9a如何通过BCL11A和ZBTB7A抑制BGLT3转录
通过ChIP-qPCR分析H3K9me2、BCL11A、ZBTB7A、CHD4在BGLT3位点的占位；通过免疫共沉淀检测蛋白相互作用；通过多肽pull-down检测H3K9me2对抑制因子结合的增强。
验证BGLT3在其他诱导剂和细胞中的普遍作用
评估BGLT3是否是化学诱导γ-珠蛋白的通用调节因子
检测羟基脲、decitabine、MS-275、SAHA处理后BGLT3表达；在BGLT3敲低的HUDEP-2细胞和HiDEP-1细胞中检测γ-珠蛋白诱导；分析BCL11A/ZBTB7A占位变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Stemline II造血干细胞扩增培养基 | Sigma | -- |
| StemSpan SFEMII培养基 | -- | -- | |
| DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 重组干细胞因子 | R&D systems | -- | |
| 重组促红细胞生成素 | Kyowa Kirin | -- | |
| 地塞米松 | Sigma | -- | |
| 多西环素 | Sigma | -- | |
| 白细胞介素3 | R&D systems | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 体外酶活检测 | AlphaLISA抗H3K9me2受体磁珠 | PerkinElmer | AL117C |
| AlphaScreen链霉亲和素供体磁珠 | PerkinElmer | 6760002B | |
| EnSpire Alpha读板器 | PerkinElmer | -- | |
| 蛋白质印迹 | 抗G9a抗体 | CST | 3306 |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Abcam | ab18251 | |
| 抗H3K9me2抗体 | Abcam | ab1220 | |
| 抗H3抗体 | Abcam | ab1791 | |
| 抗H3K27me3抗体 | Sigma | 07-449 | |
| 抗GLP抗体 | CST | 35005 | |
| 抗FLAG抗体 | Fujifilm | 01422383 | |
| 抗His抗体 | MBL | PM032 | |
| 抗BCL11A抗体 | Abcam | ab19487 | |
| 抗ZBTB7A抗体 | CST | 50565 | |
| 抗CHD3抗体 | Novus Biologicals | NB100-60412 | |
| 抗CHD4抗体 | Abcam | ab240640 | |
| RNA提取与qPCR | 组织总RNA小提试剂盒 | FAVORGEN | -- |
| qPCR | ReverTra Ace预混液 | TOYOBO | -- |
| THUNDERBIRD SYBR qPCR预混液 | TOYOBO | -- | |
| CFX Connect实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | DOJINDO | -- |
| 结晶学 | Paratone-N油 | Hampton Research | -- |
| 表面等离子共振 | Biacore T200分子互作仪 | Cytiva | -- |
| Series S SA传感芯片 | Cytiva | BR100531 | |
| NHS-PEG4-生物素 | Thermo | 39259 | |
| 色谱质谱联用 | ACQUITY超高效液相色谱仪 | Waters | -- |
| 4000 QTRAP质谱仪 | Sciex | -- | |
| Acquity UPLC BEH C18色谱柱 | Waters | -- | |
| 流式细胞术 | FACSCalibur流式细胞仪 | Becton Dickinson | -- |
| APC偶联HbF抗体 | Invitrogen | MHFH05 | |
| FITC偶联CD45抗体 | Becton Dickinson | 555482 | |
| APC偶联血型糖蛋白A抗体 | Becton Dickinson | 551336 | |
| 免疫沉淀 | 抗FLAG M2亲和凝胶 | Sigma | A2220 |
| 染色质免疫沉淀 | 微球菌核酸酶 | Takara | -- |
| 蛋白A/G PLUS-琼脂糖 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| FastGene凝胶/PCR提取试剂盒 | Nippon Genetics | -- | |
| RNA-seq | RNeasy Plus小型试剂盒 | QIAGEN | -- |
| 蛋白鉴定 | EASY-nLC 1000纳升液相色谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q-Exactive质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白定量 | Vanquish超高效液相色谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| TSQ-Vantage EMR质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | HUDEP-2细胞的培养条件（Stemline II培养基、SCF、EPO、地塞米松、多西环素浓度）、RK-701处理浓度（0-1μM）和持续时间（4天） 阅读提示：Methods 'Cell culture' 和 'Quantitative PCR (qPCR)'，以及图2a和图3e的图注 |
| 原代CD34+细胞分化 | CD34+细胞来源（骨髓或外周血）、分化培养基组成、RK-701和羟基脲处理浓度及处理时间（第7天或第9-11天）、HbF检测时间点 阅读提示：Methods 'Cell culture' 和图2b-d、图3f的图注 |
| 基因敲低/敲除 | BGLT3 shRNA靶序列、转染方法（逆转录病毒感染）、筛选时间（48小时）、嘌呤霉素浓度（0.2 μg/mL）、BGLT3敲低效率验证方法 阅读提示：Methods 'Construction of plasmids' 和 'Retroviral infection'，以及图3j、k、图7a、b的图注 |
| ChIP-qPCR | 细胞数量和交联条件、抗体使用浓度（anti-H3K9me2 1:100等）、微球菌核酸酶消化条件、qPCR引物序列 阅读提示：Methods 'Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay' 和补充材料中的引物列表 |
| 动物模型 | 小鼠品系（C57BL/6）、性别（雌性）、年龄（6-8周）、给药途径（腹腔注射）、给药剂量（20或50 mg/kg）、给药方案（每周5天持续5周）、血液采样时间点 阅读提示：Methods 'Animal experiments' 和图2f-h的图注 |