Molecular signatures and signaling interactions of the hair follicle stem cell niche
包含多细胞类型分选与转录组测序、免疫荧光验证、FISH验证、与15项已发表数据集的交叉比较以及CellChat细胞通讯分析等多个独立证据层级。
小鼠背部皮肤毛囊 DP（毛乳头）细胞 BuSC（隆突干细胞） HGSC（毛芽干细胞）
小鼠品系：K14-H2BGFP;Crabp1-GFP;Lef1-RFP 三转基因报告小鼠 细胞分选策略：FACS分选DP、BuSC、HGSC、DF、Epi、Foll和Neg七种细胞群体 转录组分析：每个样本约75百万读段的批量RNA-seq 毛囊周期阶段：P22第一周期毛囊，四个皮肤区域包含不同毛囊周期阶段 数据分析：RPKM ≥ 1且与其他群体相比差异倍数≥2的签名基因定义
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立一种可靠的方法，从同一小鼠背部皮肤中同时分离毛囊干细胞及其微环境细胞，用于后续转录组分析。
使用K14-H2BGFP;Crabp1-GFP;Lef1-RFP三转基因报告小鼠，通过FACS从P22背部皮肤分选DP（GFP+RFP+）、BuSC（GFP+CD34+）、HGSC（GFP+PCAD+）、DF（RFP+GFP-）、Epi（GFP+）、Foll（GFP+CD34-PCAD-）和Neg（标记阴性）七种细胞群体。
验证沿小鼠背部皮肤从头到尾的毛发生长再生波的存在，并确定四个区域中的毛囊周期阶段，以指导后续分选和转录组分析。
通过免疫荧光染色检测KI67和活化Caspase-3，量化四个皮肤区域的毛囊周期阶段分布。
通过高灵敏度批量RNA-seq，定义毛乳头、隆突干细胞和毛芽干细胞的细胞类型特异性分子签名，并识别新的候选调控因子。
对四个区域分选的七种细胞群体进行批量RNA-seq，使用ANOVA鉴定差异表达基因，并通过RPKM和差异倍数定义每个细胞类型在每个区域的签名基因。
通过与以往研究比较，验证本研究的签名，并识别新的、高置信度的DP、BuSC和HGSC基因。
将定义的DP、BuSC和HGSC扩展签名与来自15项已发表的小鼠和人类研究（微阵列、批量RNA-seq和单细胞RNA-seq）的签名进行交叉比较。
系统地预测毛囊干细胞和微环境之间的细胞间通讯，包括配体-受体相互作用和更广泛的信号通路。
首先使用Ramilowski数据库对签名基因进行配体-受体映射分析，然后使用CellChat对所有高表达基因（RPKM ≥ 20）进行无偏细胞间通讯分析。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞分选 | 小鼠品系、年龄、皮肤区域、FACS标记抗体和门控策略 阅读提示：Materials and Methods - Mice; 图1b-e; 方法部分关于FACS的描述 |
| RNA-seq | 文库制备方法、测序深度、生物学重复数、差异表达和签名基因的计算标准 阅读提示：Materials and Methods - RNA-seq; 图2a; 结果部分关于签名基因定义 |
| 数据比较 | 用于比较的已发表数据集及其签名生成方法 阅读提示：方法部分 - Signature gene lists for cross-comparison studies; 图3e, 4e, 5e |
| 细胞通讯分析 | 配体-受体数据库版本、CellChat参数、RPKM阈值 阅读提示：方法部分 - Ligand-receptor analysis; CellChat analysis; 图6 |
