验证糖酵解-乳酸-乳酸化轴在DR视网膜血管病变中的作用
探究DR中糖酵解激活、乳酸积累和蛋白质乳酸化与视网膜血管病变的关系
检测DR大鼠视网膜中糖酵解酶HK2、PFKFB3、PKM2、LDHA的表达，测量视网膜和血清乳酸水平，检测Pan-Kla水平，并观察H-E染色、Evans blue血管渗漏和PAS染色等病理指标。
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糖尿病视网膜病变病理性血管生成中HMGA1乳酸化修饰对SP1/VEGFA轴的调控
HMGA1 Lactylation-Mediated Regulation of the SP1/VEGFA Axis in Pathological Angiogenesis Under Diabetic Retinopathy
实验完整度
高包含大鼠模型、细胞模型、乳酸化组学、CUT&Tag、ChIP-qPCR、功能回补等多层级验证。
主要模型
Sprague-Dawley大鼠糖尿病视网膜病变模型 人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）
重点核对
糖尿病大鼠模型用STZ诱导，剂量60 mg/kg，单次腹腔注射 HRMECs高糖处理浓度为30 mmol/L，处理48小时 DCA和ROT处理浓度分别为20 mmol/L和20 nmol/L，处理48小时 HMGA1 K74R突变体用于验证乳酸化功能
摘要
糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病导致失明的主要并发症，其特点是高血糖诱导的血管功能障碍，机制尚未完全明确。我们的研究证实在DR大鼠模型中糖酵解通路被激活，导致乳酸积累和泛赖氨酸乳酸化水平升高。降低乳酸水平可改善血管功能障碍。对大鼠视网膜组织的全局乳酸化组学分析揭示了49个蛋白质在55个位点上乳酸化上调。研究结果表明，HMGA1在赖氨酸74（K74）位点的乳酸化直接促进特异性蛋白1的转录上调，增强血管内皮生长因子A的表达并加重血管功能障碍。至关重要的是，HMGA1的K74突变减轻了这些病理变化。本研究首次将HMGA1乳酸化确定为驱动DR血管功能障碍的关键分子机制，为开发针对这种特定翻译后修饰的新型诊断标志物和治疗策略提供了一个有前景的干预靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 糖尿病视网膜病变中高糖诱导的血管功能障碍是否由蛋白质乳酸化修饰介导，其分子机制是什么？
- 核心机制
- 高糖条件下，糖酵解增强导致乳酸积累，HMGA1在K74位点发生乳酸化修饰，增强其与SP1启动子的结合，促进SP1转录，进而上调VEGFA表达，加重血管功能障碍。
- 主要证据
- DR大鼠模型和高糖处理的HRMECs中观察到HMGA1 K74乳酸化水平升高；CUT&Tag和ChIP-qPCR显示HMGA1-K74la结合SP1启动子；K74R突变降低结合并抑制SP1和VEGFA表达及血管生成功能。
- 研究意义
- 本研究首次鉴定HMGA1乳酸化为DR血管功能障碍的关键分子机制，为开发针对该翻译后修饰的新型诊断标志物和治疗策略提供了潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
调节乳酸水平观察对DR大鼠视网膜病变的影响
验证降低或升高乳酸水平能否改善或加重DR的血管功能障碍
使用DCA和ROT分别降低和升高DR大鼠体内乳酸水平，检测乳酸浓度和Pan-Kla水平，并评估H-E染色、Evans blue和PAS染色等病理变化。
验证高糖诱导的乳酸化在HRMECs中的促血管生成作用
探究HG条件下HRMECs中乳酸化水平变化及其对迁移、侵袭、成管和增殖的影响
HG培养HRMECs，检测糖酵解酶、乳酸和Pan-Kla水平，并通过DCA和ROT调节乳酸水平，进行划痕、Transwell、成管和EdU实验评估功能变化。
乳酸化组学鉴定HMGA1为DR中关键乳酸化靶点
鉴定DR大鼠视网膜中发生差异乳酸化的蛋白质，并筛选关键候选蛋白
对DR和对照大鼠视网膜进行乳酸化组学分析，鉴定差异乳酸化位点和蛋白质，GO分析，并通过质谱确认HMGA1 K55和K74位点的乳酸化。
验证HMGA1 K74乳酸化对HRMECs功能的影响
确定HMGA1 K74乳酸化是否特异性促进HRMECs的迁移、侵袭、成管和增殖
利用shRNA敲低HMGA1，并过表达野生型（WT）或K74R突变体，检测HMGA1乳酸化水平及细胞功能变化。
验证HMGA1-K74la在体内外的上调
验证HMGA1 K74乳酸化在DR模型和高糖处理细胞中的特异性上调
使用特异性抗体HMGA1-K74la检测DR大鼠视网膜和HG处理的HRMECs中的水平，并观察DCA和ROT对其的影响。
揭示HMGA1-K74la调控SP1-VEGFA轴的机制
阐明HMGA1乳酸化如何通过调控SP1转录影响VEGFA表达和血管生成
通过CUT&Tag和ChIP-qPCR检测HMGA1在SP1启动子的结合，RT-qPCR和Western blot检测SP1和VEGFA表达，双荧光素酶报告基因检测启动子活性，并通过SP1敲低和回补实验验证其下游作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体 | 泛赖氨酸乳酸化抗体 | PTM Biolabs | PTM-1401 |
| CD31抗体 | Servicebio | GB12063 | |
| 己糖激酶2抗体 | Zenbio | R24552 | |
| 6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3抗体 | Zenbio | R382181 | |
| 乳酸脱氢酶A抗体 | Zenbio | R380954 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Servicebio | ZB15001 | |
| HMGA1抗体 | Abcam | ab252930 | |
| Flag抗体 | Proteintech | 20543-1-AP | |
| HMGA1-K74乳酸化抗体 | Tsingke Biotechnology | -- | |
| SP1抗体 | Proteintech | 21962-1-AP | |
| VEGFA抗体 | Zenbio | R26073 | |
| IgG抗体 | Proteintech | 30000-0-AP | |
| 细胞培养 | 人视网膜微血管内皮细胞 | Procel | CP-H130 |
| 内皮细胞培养基 | Sciencell | 1001 | |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | ISEQ00010 |
| 细胞培养 | sh-HMGA1慢病毒 | Shanghai GeneChem | -- |
| 基因敲低 | SP1靶向siRNA | Shanghai Sangon Biotech | -- |
| 糖尿病模型诱导 | 链脲佐菌素 | Sigma | S0130 |
| 药物处理 | 鱼藤酮 | Rhawn | R006873 |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | l3000015 |
| 免疫荧光 | 抗淬灭封片剂 | Servicebio | G1401 |
| 免疫共沉淀 | Protein A/G琼脂糖珠 | Santa Cruz | sc-2003 |
| 血管生成实验 | 基质胶 | Corning | 356234 |
| 乳酸化富集 | 泛赖氨酸乳酸化抗体树脂 | PTM Biolabs | PTM-1404 |
| 乳酸检测 | L-乳酸检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A019-2-1 |
| RNA提取 | RNA提取试剂盒 | Genstar | P130-01 |
| 逆转录 | 逆转录混合试剂 | Genstar | A240-10 |
| qPCR | SYBR Green I qPCR混合试剂 | Genstar | A308-05 |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0010 |
| ChIP | 染色质免疫沉淀试剂盒 | BersinBio | Bes5001 |
| 双荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Yeasen | 11402ES |
| 增殖检测 | BeyoClick EdU-488试剂盒 | Beyotime | C0071S |
| 显微镜 | 荧光/光学显微镜 | Carl Zeiss AG | Axio Vert.A1 |
| 共聚焦显微镜 | 共聚焦显微镜 | Carl Zeiss AG | LSM880 |
| 质谱 | 质谱仪 | Bruker Daltonics | timsTOF HT |
| Western blot成像 | 蛋白质印迹成像系统 | Tanon | TanonFine Dox6 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 糖尿病大鼠模型 | STZ剂量（60 mg/kg）、给药方式（单次腹腔注射）、大鼠品系、性别、年龄和体重 阅读提示：Methods: Diabetic Rat Modeling and Treatment |
| 药物处理 | DCA剂量（200 mg/kg）、ROT剂量（1.5 mg/kg）、给药频率（每3天一次）、持续时间（8周）和对照（DMSO） 阅读提示：Methods: Diabetic Rat Modeling and Treatment |
| 细胞培养与处理 | HRMECs培养条件、高糖浓度（30 mmol/L）、处理时间（48小时） 阅读提示：Methods: Cell Culture and Treatment |
| 体外功能实验 | 划痕实验时间（0和48小时）、Transwell侵袭实验细胞数（2×10^4）、Matrigel用量、成管实验细胞数（1×10^5）和培养时间（6-8小时） 阅读提示：Methods: Cell Migration Assay, Cell Invasion Assay, In Vitro Angiogenesis Assay |
| 机制验证 | sh-HMGA1慢病毒MOI（15）、转染试剂（Lipofectamine 3000）、ChIP-qPCR抗体（HMGA1, SP1）和引物序列 阅读提示：Methods: Lentiviral Infection and Plasmid Transfection, Chromatin Immunoprecipitation–qPCR, Supplementary Table 1 |