样本收集与处理
收集输精管切除术前后的配对精液和尿液样本,用于微生物组分析。
在术前和术后3个月收集精液和尿液样本,精液样本在液化前取200μl分装冻存,尿液样本加入核酸稳定剂后冻存。
The impact of vasectomy on the seminal microbiome: possible implications and source of microbes
不足
82名接受输精管切除术的男性队列
输精管切除术前和术后3个月配对精液和尿液样本 16S rRNA基因V4区扩增子测序 阴性对照和ZymoBIOMICS模拟群落阳性对照 去污染处理使用microDecon R包 统计显著阈值设定为FDR校正后P<0.05
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
收集输精管切除术前后的配对精液和尿液样本,用于微生物组分析。
在术前和术后3个月收集精液和尿液样本,精液样本在液化前取200μl分装冻存,尿液样本加入核酸稳定剂后冻存。
分析精液和尿液样本的微生物组成。
使用QIAamp试剂盒提取DNA,扩增16S rRNA基因V4区,在Illumina MiSeq平台双端测序。
获得可靠的微生物组成数据,去除污染序列。
使用QIIME2和DADA2进行降噪,基于SILVA数据库进行物种注释,使用microDecon去除污染。
比较精液与尿液微生物组差异,以及术前术后精液微生物组变化。
计算α多样性(Shannon指数和丰富度),β多样性(Bray-Curtis距离PCoA和PERMANOVA),差异丰度分析(metagenomeSeq)。
预测精液微生物组的功能改变。
使用PICRUSt2预测KEGG代谢通路,DESeq2进行差异通路分析,PCA和热图可视化。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本收集 | DELTALAB | -- | -- |
| VWR | -- | -- | |
| eNAT 608CS01R | COPAN Italia | -- | |
| DNA提取 | QIAamp DNA微生物组试剂盒 | QIAGEN | -- |
| QIAamp UCP病原体小提试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| DNA质量检测 | NanoDrop ND1000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| DNA定量 | Qubit 4 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| PCR扩增 | Platinum热启动PCR预混液 | Invitrogen | -- |
| MilliQ实验室用水 | Merck | -- | |
| Applied Biosystems Veriti 96孔热循环仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PCR产物纯化 | MicroElute循环纯化试剂盒 | Omega Bio-tek | -- |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| 质量控制 | HS生物分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| 测序 | MiSeq v3试剂盒 | Illumina | -- |
| Illumina MiSeq | Illumina | -- | |
| 阳性对照 | ZymoBIOMICS模拟群落标准品 | Zymo Research | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 纳入对象为计划行输精管切除术的男性;收集术前和术后3个月(确认无精子症)的配对精液和尿液样本;要求禁欲3-5天;精液样本无菌容器收集;尿液样本加入eNAT稳定剂。 阅读提示:Materials and methods - Study population |
| DNA提取与测序 | 使用QIAamp DNA Microbiome Kit(精液)和QIAamp UCP Pathogen Mini Kit(尿液)提取DNA;扩增16S rRNA基因V4区(引物515F/806R);PCR条件(94°C 3min,35循环94°C 45s、50°C 1min、72°C 90s,72°C 10min);Illumina MiSeq平台PE300测序。 阅读提示:Materials and methods - DNA extraction, Analysis of 16S rRNA gene sequencing |
| 微生物组分析 | 使用QIIME2和DADA2进行降噪;SILVA v138.1数据库注释;microDecon去污染;α多样性用Shannon指数和丰富度(Wilcoxon符号秩检验);β多样性用Bray-Curtis距离PCoA和PERMANOVA;差异丰度用metagenomeSeq(CSS归一化,FDR校正)。 阅读提示:Materials and methods - Microbiome analysis, Statistical analysis |
| 功能预测 | 使用PICRUSt2预测KEGG通路;DESeq2差异丰度分析(FDR校正)。 阅读提示:Materials and methods - Statistical analysis |