构建重组腺病毒AdV-SS
生成编码SIRPα/Siglec-10双特异性融合蛋白的溶瘤腺病毒，并验证其表达和功能
将编码鼠或人SIRPα和Siglec-10胞外域的融合基因克隆入腺病毒载体，通过同源重组产生重组腺病毒（AdV-mSS、AdV-huSS），感染293T细胞后检测融合蛋白表达。
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溶瘤腺病毒靶向递送双特异性融合蛋白SIRPα/Siglec-10使肿瘤相关巨噬细胞恢复活性以改善实体瘤的治疗效果
Targeted release of a bispecific fusion protein SIRPα/Siglec-10 by oncolytic adenovirus reinvigorates tumor-associated macrophages to improve therapeutic outcomes in solid tumors
实验完整度
高包含分子构建（重组腺病毒）、体外功能验证（CCK8、吞噬实验、细胞毒性）、多种动物模型（皮下、腹水、原位、人源化）、机制研究（RNA-seq、流式、免疫细胞耗竭）及安全性评估。
主要模型
H22肝癌细胞系（小鼠） MC38结直肠癌细胞系（小鼠） LLC肺癌细胞系（小鼠） LM3肝癌细胞系（人） H22-CAR腹水瘤模型（BALB/c小鼠）
重点核对
病毒滴度：5×10⁸ IFU/剂（皮下），5×10⁷ IFU/剂（腹水），1.5×10⁹ IFU（原位），5×10⁸ IFU（人源化） 给药方式：瘤内注射（皮下、原位），腹腔注射（腹水） 治疗时间：肿瘤体积约100 mm³时开始，隔日一次，共三次 细胞系：H22-CAR、MC38-CAR、LLC-CAR需表达柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)以增强感染 免疫细胞耗竭：使用抗CD8抗体、氯膦酸盐脂质体（巨噬细胞）等
摘要
背景：肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的多效性使其成为抗肿瘤药物开发中具有吸引力的靶点。CD47/SIRPα和CD24/Siglec-10信号通路被发现可抑制巨噬细胞对恶性细胞的吞噬作用。系统性阻断CD47/SIRPα已显示出严重的副作用。通过溶瘤病毒（OVs）瘤内递送CD47抑制剂可能规避这一障碍。方法：为了鉴定重组腺病毒（AdV）-SIRPα/Siglec-10的特性，我们进行了CCK8实验、定量PCR、蛋白质印迹、竞争结合实验、体外细胞毒性实验、ELISA和吞噬实验。我们使用流式细胞术、多种荷瘤小鼠模型、人源化荷瘤小鼠模型、免疫细胞耗竭、RNA测序和体外T细胞活化实验研究了AdV-SIRPα/Siglec-10的抗肿瘤免疫反应。结果：在这里，我们开发了一种新型AdV，其编码由鼠或人SIRPα和Siglec-10的胞外域组成的融合蛋白（SIRPα/Siglec-10），称为AdV-mSS或AdV-huSS。SIRPα/Siglec-10被AdV-mSS感染的细胞有效分泌，并作为CD47和CD24的双重阻断剂，从而显著增强巨噬细胞的吞噬作用。在一系列肿瘤模型中，包括皮下和腹水型H22肝细胞癌（HCC）、皮下Hepa1-6 HCC、MC38结直肠癌和Lewis肺癌，AdV-mSS治疗显著增强了抗肿瘤疗效。机制上，AdV-mSS将TAMs重编程为抗肿瘤表型，并增强主要组织相容性复合体（MHC）-I/II的表达，促进CD8+T细胞增殖和活化。巨噬细胞或CD8+T细胞的耗竭消除了AdV-mSS的抗肿瘤疗效。类似地，在人源化LM3 HCC小鼠模型中，AdV-huSS显著抑制了肿瘤生长并延长了生存期。结论：通过AdV瘤内递送双重SIRPα/Siglec-10抑制剂不仅重振了TAM-CD8+T细胞轴，还可能降低了脱靶效应的风险。在不久的将来，有必要对癌症患者进行AdV-huSS的进一步研究。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过溶瘤腺病毒瘤内递送双特异性融合蛋白SIRPα/Siglec-10来局部阻断CD47和CD24信号，从而增强肿瘤相关巨噬细胞的抗肿瘤活性并改善实体瘤的治疗效果？
- 核心机制
- AdV-SS通过局部表达双特异性SIRPα/Siglec-10融合蛋白，阻断CD47和CD24的"不要吃我"信号，从而增强TAMs的吞噬作用，并将其重编程为抗肿瘤表型，上调MHC-I/II表达，进而促进CD8+T细胞的增殖和活化，形成TAM-CD8+T细胞轴介导的抗肿瘤免疫。
- 主要证据
- 在多种皮下、腹水及原位肿瘤模型中，AdV-mSS显著抑制肿瘤生长并延长生存期；流式细胞术显示TAMs向抗肿瘤表型极化、CD8+T细胞浸润和活化增加；巨噬细胞或CD8+T细胞耗竭消除抗肿瘤效果；人源化小鼠中AdV-huSS同样有效。
- 研究意义
- 该研究表明瘤内注射AdV-SS可能是一种安全有效的抗肿瘤候选策略，尤其适用于治疗恶性腹水，并值得进一步的临床前和临床评估。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外评估AdV-SS介导的吞噬作用和细胞毒性
验证AdV-SS表达的融合蛋白是否增强巨噬细胞的吞噬能力和细胞毒性
将感染AdV-SS的细胞上清与BMDMs或MDMs及肿瘤细胞共培养，通过流式细胞术检测吞噬率，通过荧光素酶释放实验检测细胞毒性，通过ELISA检测TNF-α分泌。
体内抗肿瘤疗效评估
在多种肿瘤模型中评估AdV-mSS的体内抗肿瘤效果
建立皮下H22、Hepa1-6、MC38、LLC肿瘤模型，以及H22腹水模型、原位肝癌和结肠癌模型，瘤内或腹腔注射AdV-SS，监测肿瘤生长和生存期。
免疫微环境分析
评估AdV-mSS对肿瘤浸润免疫细胞尤其是TAMs和T细胞的影响
通过流式细胞术分析肿瘤和脾脏中免疫细胞（巨噬细胞、CD8+T细胞等）的比例和活化标志物，通过RNA-seq分析TAMs的转录组变化。
机制验证：巨噬细胞-CD8+T细胞轴
验证AdV-mSS是否通过TAM-CD8+T细胞轴发挥抗肿瘤作用
将AdV-mSS处理的TAMs与OT-I T细胞共培养，检测T细胞增殖和IFN-γ产生；通过抗体耗竭CD8+T细胞或巨噬细胞，观察抗肿瘤效果的丧失。
人源化模型验证
评估AdV-huSS在人源化小鼠模型中的抗肿瘤效果
在NCG小鼠皮下接种LM3细胞，重建人PBMCs后，瘤内注射AdV-huSS，监测肿瘤生长和体重变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099158 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140163 | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | -- | -- | |
| 病毒构建 | pAd/PL-DEST载体 | Invitrogen | -- |
| PacI限制性内切酶 | -- | -- | |
| 病毒扩增 | 六邻体蛋白抗体 | Abcam | ab2596 |
| HRP标记抗体 | Invitrogen | 31430 | |
| DAB底物 | Proteintech | PK10005 | |
| qPCR | TIANamp基因组DNA试剂盒 | TIANGEN | DP304 |
| Trizol试剂 | Vazyme | -- | |
| HiScript III反转录预混液 | Vazyme | R323 | |
| SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q511 | |
| ViiA 7实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| DYKDDDDK标签单克隆抗体 | Invitrogen | MA1-91878 | |
| Siglec-10多克隆抗体 | Invitrogen | PA5-55501 | |
| β-肌动蛋白单克隆抗体 | Invitrogen | MA1-140 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Invitrogen | A16068 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Invitrogen | 31460 | |
| 竞争结合实验 | FITC标记的抗CD47抗体 | -- | -- |
| PerCP-Cy5.5标记的抗CD24抗体 | -- | -- | |
| 吞噬实验 | 胰蛋白酶-EDTA | -- | -- |
| PerCP-Cy5.5标记的抗CD11b抗体 | -- | -- | |
| BD FACS Calibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| CytoFLEX LX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 细胞毒性实验 | D-荧光素 | Promega | -- |
| BioTek Synergy H4酶标仪 | BioTek | -- | |
| 细胞因子检测 | ELISA MAX Deluxe Set TNF-α试剂盒 | BioLegend | 430904/430204 |
| ELISA MAX Deluxe Set小鼠IFN-γ试剂盒 | BioLegend | 430804 | |
| 动物实验 | 抗CD4抗体 | Bio X Cell | -- |
| 抗CD8抗体 | Bio X Cell | -- | |
| 抗asialo GM1抗体 | Wako | -- | |
| 流式细胞术 | IV型胶原酶 | Thermo Fisher Scientific | 17104019 |
| Fc受体阻断剂（抗CD16/32） | -- | -- | |
| 固定/破膜试剂盒 | BD Biosciences | -- | |
| RNA-seq | 抗F4/80磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-110-443 |
| RNeasy小提Plus试剂盒 | Qiagen | 74134 | |
| Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| T细胞活化实验 | CFSE染料 | eBioscience | 65-0850-84 |
| 抗CD8a抗体 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组腺病毒构建 | 腺病毒构建细节（穿梭质粒、同源重组、PacI消化） 阅读提示：Materials and methods - Adenovirus construction |
| 体外吞噬实验 | 效应细胞（BMDMs/MDMs）与靶细胞比例、共培养时间、肿瘤细胞表达YFP 阅读提示：Materials and methods - Phagocytosis assay |
| 皮下肿瘤模型 | 细胞系（H22-CAR、MC38-CAR等）、接种细胞数、病毒剂量（5×10⁸ IFU）、给药方式（瘤内）、注射次数及频率 阅读提示：Materials and methods - Animal experiment， Figure 2 |
| 腹水肿瘤模型 | H22-CAR细胞接种数量、病毒剂量（5×10⁷ IFU）、给药方式（腹腔注射） 阅读提示：Materials and methods - Animal experiment |
| 原位肿瘤模型 | 手术细节、病毒剂量（1.5×10⁹ IFU）、注射方式（瘤内） 阅读提示：Materials and methods - Animal experiment |
| 人源化模型 | NCG小鼠、LM3细胞接种数、人PBMCs数量、病毒剂量（5×10⁸ IFU）、给药方式（瘤内） 阅读提示：Materials and methods - Animal experiment |
| 免疫细胞耗竭 | 耗竭抗体类型及剂量（200μg/只）、给药频率、氯膦酸盐脂质体剂量（150μL 7mg/mL） 阅读提示：Materials and methods - Animal experiment |