检测AKR1D1在肝癌中的表达
明确AKR1D1在肝癌组织中的表达情况。
通过qRT-PCR、免疫印迹和免疫组化检测配对肝癌及癌旁组织中AKR1D1的mRNA和蛋白水平，并分析TCGA数据库。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
AKR1D1通过促进胆汁酸代谢介导的NK细胞细胞毒性抑制肝癌进展
AKR1D1 suppresses liver cancer progression by promoting bile acid metabolism-mediated NK cell cytotoxicity
实验完整度
高包含多种小鼠肝癌模型（DEN、细胞系、自发）、体外NK细胞功能实验、代谢组学、微生物组测序及临床样本验证，并进行功能与机制验证。
主要模型
肝癌患者组织样本 小鼠DEN诱导肝癌模型 小鼠Hepa1-6和RIL-175细胞移植瘤模型 AKR1D1基因敲除小鼠
重点核对
AKR1D1在肝癌组织中的表达水平（免疫印迹、免疫组化） AKR1D1缺失对肝癌进展的影响（多种小鼠模型） NK细胞在AKR1D1介导的肝癌抑制中的作用（抗体清除、基因敲除、IL-15激活） iso-LCA对NK细胞细胞毒性的影响（体外培养、体内给药） B. ovatus与iso-LCA产生的关系（相关性分析、厌氧培养）
摘要
胆汁酸代谢和抗肿瘤免疫在肝癌进展过程中均受到干扰。然而，它们之间复杂的调控关系仍不清楚。在此，我们发现醛酮还原酶1D1（AKR1D1）的缺失通过肠道微生物群失调促进异石胆酸（iso-LCA）的积累，从而损害自然杀伤（NK）细胞的细胞毒性功能，并导致肝细胞癌（HCC）的加速发展。机制上，AKR1D1缺陷导致拟杆菌属卵形拟杆菌（B. ovatus）比例增加，后者将鹅去氧胆酸（CDCA）分解为iso-LCA。此外，积累的iso-LCA以磷酸化CREB1（p-CREB1）依赖的方式损害肝脏NK细胞的抗肿瘤活性。保钾利尿剂螺内酯通过靶向iso-LCA介导的肿瘤免疫逃逸，显著增强抗PD1抗体对HCC进展的抑制作用。总之，我们的结果揭示了AKR1D1与HCC之间先前未被认识的联系，并提示靶向B. ovatus产生的iso-LCA可能是激活NK细胞细胞毒性以治疗HCC的有前景的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- AKR1D1是否通过影响胆汁酸代谢和抗肿瘤免疫来调控肝癌进展？
- 核心机制
- AKR1D1缺失导致肠道B. ovatus丰度增加，将CDCA分解为iso-LCA，iso-LCA通过抑制NK细胞中CREB1磷酸化，损害NK细胞细胞毒性，从而促进肝癌进展。
- 主要证据
- 多种小鼠肝癌模型中AKR1D1缺失促进肿瘤生长；RNA-seq和流式细胞术显示NK细胞数量及功能下降；代谢组学和微生物组分析显示iso-LCA和B. ovatus增加；体外实验证实iso-LCA抑制NK细胞功能并依赖于p-CREB1。
- 研究意义
- 揭示了AKR1D1通过调控肠道菌群-胆汁酸轴影响NK细胞功能的新机制，为肝癌治疗提供了靶向iso-LCA的潜在策略，如使用螺内酯增强抗PD1疗效。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立AKR1D1敲除小鼠并诱导肝癌模型
评估AKR1D1缺失对肝癌发生发展的影响。
使用CRISPR-Cas9生成Akr1d1敲除小鼠，并建立DEN诱导、Hepa1-6/RIL-175移植、YAP5SA、自发等肝癌模型。
验证NK细胞在AKR1D1介导的肿瘤抑制中的作用
确定NK细胞是否是AKR1D1调控肝癌的关键免疫细胞。
通过流式细胞术检测肿瘤浸润免疫细胞比例，使用抗NK1.1抗体清除NK细胞、Eomes条件敲除小鼠及IL-15激活实验，观察对肝癌进展的影响。
鉴定AKR1D1缺失引起的胆汁酸变化
寻找AKR1D1缺失导致的关键胆汁酸代谢物。
通过LC-MS靶向代谢组学分析肝组织和血清中胆汁酸组成，比较WT和AKR1D1KO小鼠的差异。
验证iso-LCA对NK细胞功能的影响
确定iso-LCA是否直接抑制NK细胞功能并促进肿瘤。
分离小鼠脾脏NK细胞，用iso-LCA处理，检测细胞因子分泌和杀伤能力；体内注射iso-LCA观察肿瘤生长。
研究iso-LCA抑制NK细胞功能的机制
阐明iso-LCA抑制NK细胞功能的分子机制。
检测NK细胞中多种转录因子的磷酸化水平，发现p-CREB1被抑制，并通过siRNA敲低Creb1验证其对细胞因子的调控。
确定B. ovatus与iso-LCA产生的关联
探索AKR1D1缺失导致iso-LCA升高的肠道菌群机制。
对WT和AKR1D1KO小鼠肠道内容物进行宏基因组测序，分析菌群组成，并进行相关性分析。体外厌氧培养B. ovatus，检测其转化CDCA为iso-LCA的能力。
评估iso-LCA拮抗剂螺内酯的治疗潜力
验证靶向iso-LCA是否能增强抗肿瘤免疫治疗的效果。
通过分子对接和细胞热位移实验研究螺内酯与GPBAR1的结合，并在小鼠模型中评估螺内酯单独或联合抗PD1抗体的疗效。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫印迹 | 抗AKR1D1兔多克隆抗体 | Sangon Biotech | D221559 |
| 流式细胞术 | PE抗小鼠IFN-γ抗体 | Biolegend | 505826 |
| FITC抗小鼠NK-1.1抗体 | Biolegend | 108706 | |
| 药物处理 | 螺内酯 | MCE | HY-B0561 |
| 异石胆酸 | BioChemPartner | BCP41045 | |
| 细菌培养 | 卵形拟杆菌 | Mingzhoubio | B80310 |
| 嗜酸乳杆菌 | Mingzhoubio | BMZ140444 | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | C11875500BT |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141 | |
| 青霉素-链霉素 | Biological Industries | 03-031-1 | |
| NK细胞培养 | 鼠源IL-2 | PeproTech | 212-12 |
| 鼠源IL-15 | PeproTech | 210-15 | |
| 代谢物处理 | 鹅去氧胆酸 | MCE | HY-N0593 |
| 代谢物分析 | 超高效液相色谱/高分辨质谱系统 | Waters Corp. | -- |
| Acquity BEH C18色谱柱 | Waters Corp. | -- | |
| 流式细胞术 | BD Cytofix/Cytoperm固定/破膜试剂盒 | BD | 554714 |
| eBioscience™ Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | invitrogen | 00-5523-00 | |
| DNA提取 | 粪便基因组DNA提取试剂盒 | CWBIO | CW20925 |
| NK细胞分离 | 小鼠NK细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-115-818 |
| 细胞转染 | Lipofectamine RNAi MAX转染试剂 | Thermo Fisher | 13778030 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 10296010CN |
| qRT-PCR | SYBR Green预混液（不含ROX） | Vazyme | Q711-02 |
| 免疫印迹 | Western ECL底物 | Bio-Rad | 170561 |
| 药物筛选 | 奥贝胆酸 | MCE | HY-12222 |
| 乌倍他索 | MCE | HY-B0878 | |
| 胆酸 | MCE | HY-N0324 | |
| 脱氧胆酸 | MCE | HY-76847 | |
| 布瑞诺龙 | GLPBIO | GC14192 | |
| 孕酮 | MCE | HY-N0437 | |
| 熊去氧胆酸 | MCE | HY-13771 | |
| 代谢物分析 | 异胆酸 | MCE | HY-W747583 |
| 别胆酸 | MCE | HY-125934 | |
| 3β-熊去氧胆酸 | MCE | HY-113478 | |
| 去氢石胆酸 | MCE | HY-B1393 | |
| 石胆酸 | MCE | HY-B0172 | |
| 组织学 | 伊红染色液 | WEXIS | 311020007 |
| Lillie-Mayer苏木素溶液 | WEXIS | 311020001 | |
| 细菌培养 | 血琼脂平板 | HuanKai Biology | 024070 |
| MRS培养基 | HuanKai Biology | 027312 | |
| 动物实验 | 腺相关病毒 | OBiO | -- |
| 细胞培养 | 马血清 | Thermo Fisher | 16050122 |
| 叶酸 | MCE | HY-16637 | |
| β-巯基乙醇 | Thermo Fisher | 31350010 | |
| 肌醇 | Sigma | 1340960 | |
| MEM α培养基 | Gibco | 12571063 | |
| 抗生素处理 | 万古霉素 | Solarbio | V8050 |
| 新霉素 | MCE | HY-150520 | |
| 亚胺培南-西司他丁 | MeilunBio | MB1748 | |
| 免疫组化 | 白蛋白单克隆抗体 | Proteintech | 66051-1-lg |
| 免疫印迹 | 抗兔二抗 | Bio-Rad | 170-6515 |
| 抗鼠二抗 | Bio-Rad | 170-6516 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系（C57BL/6J）、性别（雄性）、年龄（6-8周龄）、DEN剂量（25 mg/kg）、细胞注射数量（2-3×10^6） 阅读提示：STAR★Methods: Mouse liver cancer models; Experimental model and study participant details |
| NK细胞功能检测 | NK细胞分离方法、IL-2/IL-15浓度、iso-LCA处理浓度（100 μM）、处理时间（48小时）、细胞因子检测方法 阅读提示：STAR★Methods: Mouse primary NK cell isolation; NK cell culture and treatment; Flow cytometry |
| 胆汁酸分析 | LC-MS方法、流动相、色谱柱、内标（氯磺丙脲）、样本制备方法 阅读提示：STAR★Methods: Bile acid analysis |
| 菌群分析 | 宏基因组测序方法、数据处理流程、相关性分析方法 阅读提示：STAR★Methods: Metagenomics sequencing; Quantification and statistical analysis |
| 药物治疗 | 螺内酯剂量（25 mg/kg）、抗PD1抗体剂量（50 μg/25g）、给药频率（每周两次）、iso-LCA剂量（0.25 mg/15g） 阅读提示：STAR★Methods: Mouse treatments |