建立病毒性脑炎小鼠模型
模拟人类病毒性脑炎的神经病理特征，用于研究SARM1的作用。
成年C57BL/6J小鼠颅内接种JEV、HSV-1或RABV，观察生存率、体重变化和临床评分。
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将SARM1作为嗜神经病毒感染的新型神经保护治疗靶点
Targeting SARM1 as a novel neuroprotective therapy in neurotropic viral infections
实验完整度
高研究包含体外细胞模型（原代皮层神经元、Neuro-2a）和体内小鼠模型，同时使用基因敲除和药理学抑制剂进行功能验证，并进行了机制探索（线粒体损伤、钙稳态）和生存分析。
主要模型
C57BL/6J小鼠及Sarm1敲除小鼠的病毒性脑炎模型 原代皮层神经元 Neuro-2a细胞
重点核对
病毒株：JEV SA14-14-2株、HSV-1 17 syn+株、RABV CVS-11株 感染剂量：2×10^6 PFU（JEV、HSV-1）或2×10^6 TCID50（RABV），颅内注射 SARM1抑制剂处理：FK866或SIC4，20 mg/kg，腹腔注射，每日两次，从感染后1天开始 SARM1敲除小鼠（Sarm1KO，C57BL/6J背景） 检测时间点：JEV/HSV-1感染后5天，RABV感染后8天
摘要
由嗜神经病毒感染引起的病毒性脑炎会导致严重的神经损伤、炎症，且死亡率高、预后差。目前，缺乏针对该疾病的有效靶向治疗方法，这构成了重大的公共卫生问题。SARM1已被确定为多种神经病变中轴突变性和炎症的关键介导因子，其激活由NMN/NAD+比率升高触发。然而，关于SARM1介导的病毒性脑炎发病机制的综合体内研究仍然缺乏。在本研究中，我们使用日本脑炎病毒（JEV）、单纯疱疹病毒-1（HSV-1）和狂犬病病毒（RABV）作为代表性病原体，建立了病毒性脑炎小鼠模型。我们的研究结果表明，嗜神经病毒感染通过激活SARM1，在皮层神经元中引发强烈的轴突变性、线粒体功能障碍和深刻的神经病理损伤。在病毒性脑炎小鼠模型中，SARM1的缺失或抑制有效保留了轴突形态并维持了线粒体稳态，同时也减弱了皮层中CD45+白细胞的浸润。因此，这些干预措施改善了小鼠的神经病理损伤并提高了存活率。我们的研究结果表明，SARM1介导的轴突变性和脑部炎症加剧了病毒性脑炎的病理进展。靶向SARM1的疗法成为在嗜神经病毒感染背景下保护神经元功能的可行且有前景的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SARM1是否在嗜神经病毒感染的病毒性脑炎中发挥致病作用，并可作为治疗靶点？
- 核心机制
- 神经病毒感染激活SARM1，导致NAD+耗竭、cADPR产生、线粒体功能障碍（膜电位丧失、钙稳态失调、嵴密度降低）和轴突变性，并促进脑部炎症，加剧神经病理。
- 主要证据
- 在JEV、HSV-1和RABV感染的小鼠模型中，SARM1表达上调，NAD+降低，cADPR升高，轴突变性明显；Sarm1敲除或SIC4/FK866抑制可保护轴突、维持线粒体功能、减轻神经炎症和病理损伤，并提高存活率。
- 研究意义
- 该研究提示SARM1抑制剂（FK866和SIC4）可能作为治疗特定类型病毒性脑炎及其他伴有轴突变性和脑炎症的神经退行性疾病的潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测SARM1表达与激活
验证病毒感染后皮层神经元中SARM1表达上调并激活。
Western blot检测SARM1和NMNAT2水平，免疫组化观察SARM1定位；检测皮层NAD+和cADPR水平，并用CD38抑制剂1验证SARM1的贡献。
评估轴突变性
确认病毒感染导致皮层神经元轴突变性，并探索SARM1的作用。
使用免疫荧光和免疫组化检测神经丝蛋白（Nf-M、β III tubulin），评估轴突变性指数；检测血浆Nf-L水平作为生物标志物。
SARM1功能获得或缺失实验
确定SARM1在病毒诱导的轴突变性和线粒体损伤中的必要作用。
使用Sarm1KO小鼠和SARM1抑制剂（SIC4、FK866）处理，分析轴突保护、线粒体功能、神经病理和生存期。
评估神经炎症反应
研究SARM1对病毒性脑炎中神经炎症的影响。
ELISA检测促炎因子（IFN-γ、TNF-α、IL-6），免疫组化检测胶质细胞活化（Iba-1、GFAP），流式细胞术定量CD45+免疫细胞浸润。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Hyclone | SH30243.FS |
| 胎牛血清 | Gibco | A5669801 | |
| 病毒滴定 | 胰蛋白酶-EDTA溶液 | Gibco | 25200072 |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂 | Gibco | 17075029 | |
| 神经培养 | 脱氧核糖核酸酶I | NEB | M0303L |
| 细胞培养 | 多聚鸟氨酸/层粘连蛋白 | Corning | 354658 |
| 神经基础培养基 | Gibco | -- | |
| B27添加剂 | Gibco | -- | |
| Glutamax添加剂 | Gibco | 35050061 | |
| 庆大霉素 | Gibco | 15710064 | |
| 药物处理 | CD38抑制剂1 | Selleck | T14913 |
| FK866 | Selleck | T2644 | |
| SIC4 | Accela ChemBio Co., Ltd | 287196-91-2 | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Beyotime | P1046 | |
| 抗SARM1抗体 | Abcam | ab226930 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 抗Cox IV抗体 | Proteintech | 11242-1-AP | |
| 抗NMNAT2抗体 | Proteintech | 27698-1-AP | |
| 抗Nf-M抗体 | Novus | NB300-133 | |
| 抗JEV-NS1抗体 | Genetex | GTX633820 | |
| 抗HSV-1-gD抗体 | Santa Cruz | sc-21719 | |
| 抗RABV-G抗体 | Merck | MABF1967 | |
| HRP标记的抗兔抗体 | Thermo | 31460 | |
| HRP标记的抗小鼠抗体 | Thermo | 31430 | |
| ECL检测试剂盒 | NCM Biotech | P10300 | |
| Amersham ImageQuant 800成像系统 | Cytiva | -- | |
| 免疫组织化学 | 柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0） | Beyotime | P0083 |
| S-vision免疫组化聚合物抗体（山羊抗兔）试剂盒 | Servicebio | G1302 | |
| ImmPRESS-AP马抗小鼠IgG聚合物检测试剂盒 | Vectorlabs | MP-540215 | |
| 抗β III微管蛋白抗体 | Abcam | ab18207 | |
| 抗Iba1抗体 | FUJIFILM | 019-19741 | |
| 抗GFAP抗体 | Merck | MAB360 | |
| 抗NeuN抗体（克隆A60） | Merck | MAB377 | |
| 组织学 | 尼氏染色液 | Beyotime | C0117 |
| 免疫荧光 | Tissue-Tek OCT包埋剂 | Saint Louis | 4583 |
| Leica CM1860冷冻切片机 | Leica | -- | |
| 含DAPI的Vectashield封片剂 | -- | -- | |
| 抗P2RY12抗体 | Novus | NBP2-33870 | |
| 抗RABV-G抗体（FUJIREBIO） | FUJIREBIO | 800-092 | |
| 代谢物检测 | NAD/NADH检测试剂盒 | Abcam | ab65348 |
| 荧光cADP-核糖检测试剂盒 | Merck | MAK553 | |
| ELISA | 小鼠Nf-L ELISA试剂盒 | Novus | NBP2-80299 |
| 小鼠IFN-γ ELISA试剂盒 | Neobioscience | EMC101g.96 | |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Neobioscience | EMC102a.96 | |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Neobioscience | EMC004.96 | |
| 流式细胞术 | Hank's平衡盐溶液 | Sigma-Aldrich | H6648 |
| 胶原酶D | Roche | 05401020001 | |
| 70 μm滤膜 | Falcon | 352350 | |
| Percoll分离液 | Sigma-Aldrich | P1644 | |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | 11875119 | |
| 纯化的大鼠抗小鼠CD16/32抗体 | BioLegend | 101302 | |
| PE标记的抗小鼠CD45抗体 | BioLegend | 103105 | |
| Beckman CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman | -- | |
| 线粒体功能 | TMRM染料 | Sigma-Aldrich | T5428 |
| MitoTracker Green染料 | Invitrogen | M7514 | |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | 31985070 | |
| FCCP解偶联剂 | Targetmol | T6834 | |
| 钙离子检测 | Fluo-8 AM钙离子荧光探针 | Abcam | ab142773 |
| 免疫荧光 | 抗TOM20抗体 | Santa Cruz | sc-17764 |
| 共聚焦显微镜 | 共聚焦激光扫描显微镜（TCS-SP8） | Leica | -- |
| 线粒体分离 | 细胞线粒体分离试剂盒 | Beyotime | C3601 |
| 透射电镜 | Karnofsky固定液 | Sangon biotech | E672005 |
| EMbed 812环氧树脂 | Emcn | GE14120 | |
| H-7650透射电子显微镜 | Hitachi | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型与病毒感染 | 小鼠品系（C57BL/6J野生型和Sarm1敲除小鼠）、年龄（8-10周）、病毒株（JEV SA14-14-2、HSV-1 17 syn+、RABV CVS-11）、接种剂量（JEV/HSV-1: 2×10^6 PFU，RABV: 2×10^6 TCID50）、接种方式（颅内注射）、接种坐标（X=1.00 mm, Y=0.80 mm, Z=1.5 mm） 阅读提示：Methods: Mice, Viruses, Mouse infections and survival studies |
| 药物处理 | 药物名称（FK866、SIC4）、给药剂量（20 mg/kg）、给药途径（腹腔注射）、给药频率（每日两次）、给药开始时间（感染后1天）、溶剂对照（PEG-300/PBS/DMSO） 阅读提示：Methods: Pharmacological interference with CD38 inhibitor 1, FK866 or SIC4 |
| 轴突变性检测 | 检测时间点（JEV/HSV-1感染后5天，RABV感染后8天）、检测标志物（Nf-M、β III tubulin）、轴突变性指数阈值（DI≥0.35）、血浆Nf-L检测 阅读提示：Results: Axonal degeneration...; Methods: Immunofluorescence, ELISA |
| 线粒体功能检测 | 细胞模型（Neuro-2a）、感染复数（MOI=1）、检测时间点（感染后36小时）、SIC4浓度（10 μM）、FCCP浓度（50 μM）、TMRM/MitoTracker Green浓度（100 nM）、Fluo-8 AM浓度（5 μM） 阅读提示：Methods: Flow cytometry (mitochondrial depolarization, calcium detection), Transmission electron microscopy |
| 神经炎症评估 | 检测时间点（JEV/HSV-1感染后5天，RABV感染后8天，慢性感染35天）、组织（大脑皮层）、细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-6）、胶质细胞标志物（Iba-1、GFAP）、CD45+细胞 阅读提示：Results: Deletion of Sarm1...; Methods: ELISA, Immunohistochemistry, Flow cytometry |