比较PFs、RFs和CAFs的特征
明确三种成纤维细胞亚型在形态、增殖和基因表达上的差异。
从皮肤和肿瘤组织中分离PFs、RFs和CAFs，进行形态观察、生长曲线测定、crystal violet染色、qPCR、Western blot、免疫荧光和scRNAseq数据分析。
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靶向肿瘤-基质相互作用中癌症相关成纤维细胞重编程的不同信号通路的小分子抑制剂鉴定
Identification of Small-Molecule Inhibitors Targeting Different Signaling Pathways in Cancer-Associated Fibroblast Reprogramming under Tumor-Stroma Interaction
实验完整度
高包含体外二维培养、三维全层皮肤模型、患者来源原代细胞及scRNAseq数据分析，并通过功能实验和机制验证抑制剂作用。
主要模型
皮肤鳞状细胞癌细胞系MET2 原代人乳头状成纤维细胞（PFs） 原代人网状成纤维细胞（RFs） 原代癌症相关成纤维细胞（CAFs） MET2三维全层皮肤模型（FTMs）
重点核对
TGFβ抑制剂SB-431542和LY3200882的使用浓度为10 μM PI3K抑制剂LY294002的使用浓度为10 μM，omipalisib的使用浓度为1 μM mTOR抑制剂everolimus和rapamycin的使用浓度为5 μM NOTCH抑制剂PF-03084014和DAPT的使用浓度为10 μM MET2 FTMs含有10 × 10^4 cells/ml的成纤维细胞和7.5 × 10^4 MET2细胞，处理14天
摘要
癌症相关成纤维细胞（CAFs）在许多癌症类型（包括皮肤鳞状细胞癌）中通过多种信号通路与肿瘤细胞相互交流。在正常成纤维细胞亚型中，乳头状成纤维细胞（PFs）和网状成纤维细胞（RFs）对肿瘤细胞信号的反应不同，最终导致RFs而非PFs分化为CAFs。成纤维细胞亚型分化的调控仍研究甚少。在本研究中，我们评估了PFs、RFs和CAFs之间的差异，并检测了靶向TGFβ、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/mTOR和NOTCH通路的小分子抑制剂对CAFs的促肿瘤特性及CAF重编程在二维和三维培养中的影响。阻断TGFβ和磷脂酰肌醇3-激酶强烈地失活并同时诱导RFs和CAFs呈现PF表型。将皮肤鳞状细胞癌细胞系MET2与RFs或CAFs进行三维共培养导致肿瘤侵袭增强、RF–CAF转变和细胞因子产生增加，而这些效应通过阻断TGFβ和磷脂酰肌醇3-激酶/mTOR通路（而非NOTCH通路）进一步受到抑制。总之，该研究鉴定了PFs、RFs和CAFs的生物标志物，并展示了阻断关键信号通路对CAFs及肿瘤细胞–CAF相互作用的不同效应。这些发现提示了一种CAF向PF转化的治疗策略，并为在基于CAF的癌症治疗中使用所包含的抑制剂提供了前景。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在肿瘤-基质相互作用下，靶向TGFβ、PAM和NOTCH通路是否可以失活并重编程癌症相关成纤维细胞（CAFs），以及这些通路在CAF亚型分化中的作用。
- 核心机制
- TGFβ和PI3K通路在维持CAF激活状态和促进CAF肿瘤促进特性中起关键作用，而NOTCH通路作用有限；阻断TGFβ和PI3K可诱导CAF/RF向PF表型去分化。
- 主要证据
- 通过二维培养和三维FTMs，结合scRNAseq分析，发现TGFβ和PI3K抑制剂降低CAF标志物表达、减少细胞因子分泌、抑制MET2细胞增殖和侵袭，并诱导PF基因表达。
- 研究意义
- 研究结果为CAF靶向治疗提供新策略，即通过诱导CAF向PF转化来抑制肿瘤进展，并支持使用TGFβ和PI3K抑制剂作为CAF相关癌症治疗的潜在方法。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估抑制剂对CAF功能的影响
检测TGFβ、PI3K、mTOR和NOTCH抑制剂对CAF诱导的MET2细胞迁移和增殖的影响。
使用CAF条件培养基处理MET2细胞，进行划痕实验和WST-1细胞活力检测，同时观察细胞形态和N-cadherin表达。
在三维FTMs中测试抑制剂效果
在更接近体内的三维模型中验证抑制剂对肿瘤细胞增殖和侵袭的影响。
建立包含PFs、RFs或CAFs的MET2 FTMs，用抑制剂处理14天，通过H&E染色、Ki-67免疫组化和vimentin免疫荧光评估肿瘤体积、增殖和EMT标志物。
研究抑制剂对成纤维细胞重编程的影响
检测抑制剂是否能将RFs和CAFs去活化为PF样表型。
用抑制剂处理RFs和CAFs 72小时，通过qPCR和免疫荧光检测亚型特异性标志物表达，并在FTMs中检测α-SMA、COL11A1、decorin和CAV1的表达。
分析炎症表型和细胞因子释放
评估抑制剂对CAF来源的炎性细胞因子产生和释放的影响。
通过scRNAseq分析细胞间相互作用和KEGG富集，用qPCR检测CAF中HGF、IL-6、IL-8、IL-11和CCL11的表达，并用Luminex检测FTM上清中的细胞因子水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抑制剂处理 | SB-431542 | Tocris Bioscience | 14A/237410 |
| LY294002 | Sigma-Aldrich | L9908 | |
| 依维莫司 | Sigma-Aldrich | SML2282 | |
| PF-03084014 | Sigma-Aldrich | PZ0298 | |
| LY3200882 | MedChemExpress | HY-103021 | |
| 奥米帕利塞 | MedChemExpress | HY-10297 | |
| 雷帕霉素 | MedChemExpress | HY-10219 | |
| DAPT | MedChemExpress | HY-13027 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Greiner | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | -- | |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞分离 | 胶原酶 | Gibco/Thermo Fisher Scientific | -- |
| 分散酶II | Roche Diagnostics | -- | |
| 细胞活力检测 | WST-1试剂盒 | Roche Diagnostics | -- |
| Western blotting | M-PER裂解缓冲液 | -- | -- |
| TGX凝胶 | Bio-Rad | -- | |
| CDH2抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5-15633 | |
| N-钙粘蛋白抗体 | Proteintech | 22018-1-AP | |
| 裂解NOTCH1抗体 | Cell Signaling Technology | 4147 | |
| HES1抗体 | Cell Signaling Technology | 11988 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 辣根过氧化物酶偶联二抗 | -- | -- | |
| ECL底物 | Pierce | -- | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| 免疫组织化学 | Ki-67抗体 | Dako | MIB1 |
| CAV1抗体 | Elabscience | E-AB-70344 | |
| 核心蛋白聚糖抗体 | GeneTex | GTX101250 | |
| 免疫荧光 | CLEC3B抗体 | Abcam | ab51883 |
| CCRL1抗体 | Abcam | ab74806 | |
| TGM2抗体 | Abcam | ab2386 | |
| CLU抗体 | Sino Biological | 11297-MM01 | |
| VCAM-1抗体 | Abcam | ab134047 | |
| CNN抗体 | Abcam | ab700 | |
| α-平滑肌肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | 2547 | |
| COL11A1抗体 | Oncomatrix | CI0011 | |
| POSTN抗体 | Proteintech | 66491-1-Ig | |
| 磷酸化SMAD2/3抗体 | Abclonal | AP0548 | |
| 磷酸化蛋白激酶B抗体 | Cell Signaling Technology | 9271 | |
| 磷酸化mTOR抗体 | Abclonal | AP0094 | |
| 广谱细胞角蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | C5992 | |
| 波形蛋白抗体 | Abcam | ab92547 | |
| 细胞因子检测 | 肝细胞生长因子 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| 白细胞介素-6 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| 白细胞介素-8 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| Bio-Plex Pro人细胞因子筛查标准品 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| 设备 | 酶标仪 | Thermo Scientific | -- |
| Bio-Plex 200系统 | Bio-Rad Laboratories | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 抑制剂处理 | 抑制剂种类、浓度：TGFβi-1 (SB431542)和TGFβi-2 (LY3200882)为10 μM，PI3Ki-1 (LY294002)为10 μM，PI3Ki-2 (omipalisib)为1 μM，mTORi-1 (everolimus)和mTORi-2 (rapamycin)为5 μM，NOTCHi-1 (PF-03084014)和NOTCHi-2 (DAPT)为10 μM；处理时间72小时。 阅读提示：Materials and Methods: Chemicals and reagents; Cell culture; Results: Figure 2 legend |
| 细胞培养 | PFs和RFs分离自女性腹部或乳房皮肤，深度100-300 μm和至少700 μm；CAFs来自cSCC肿瘤活检；所有成纤维细胞在5代内使用，培养在F5培养基；MET2细胞培养在K5培养基。 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture; Supplementary Materials and Methods: Isolation of primary fibroblasts |
| 三维FTMs | FTMs中的成纤维细胞密度为10 × 10^4 cells/ml，MET2细胞接种量为7.5 × 10^4；培养条件：K0培养基添加1% BSA、1% FBS、15 μM亚油酸、7 μM花生四烯酸、25 μM棕榈酸、252 μM维生素C和0.95 μM维生素E，从第12天起无FBS；抑制剂处理14天。 阅读提示：Supplementary Materials and Methods: The establishment of MET2 full-thickness models; Results: Figure 3 legend |
| 划痕实验 | MET2细胞接种密度50 × 10^4 cells/well；用CAF-CM或抑制剂处理的CAF-CM预处理24小时；划痕后使用F0或含CM的F0培养基（1:1）培养；观察0和12小时。 阅读提示：Supplementary Materials and Methods: Scratch assay |
| 细胞活力检测 | 直接处理：MET2, PFs, RFs, CAFs接种密度3000 cells/well，处理72小时；CAF介导的增殖：MET2接种密度1000 cells/well，使用含抑制剂处理的CAF-CM和1% FBS的F0（1:1）处理72小时；WST-1试剂使用。 阅读提示：Supplementary Materials and Methods: Cell viability assay |
| qPCR | 引物序列见补充表S1；使用SDHA、TBP和HPRT作为参考基因。 阅读提示：Supplementary Materials and Methods: Supplementary Table S1 |