建立HFD喂养的APP/PS1小鼠模型
模拟高脂饮食诱导的胰岛素抵抗和肥胖，并研究其对AD病理的影响。
3个月龄雄性APP/PS1小鼠随机分为chow、HFD、HFD+BCAAs和HFD-BCAAs组，分别喂食标准饮食或HFD（BCAAs含量调整至200%或50%）6个月。
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积累的支链氨基酸和支链酮酸通过功能失调的TREM2相关小胶质细胞β-淀粉样蛋白清除减少导致高脂饮食诱导的阿尔茨海默病恶化
Accumulated BCAAs and BCKAs contribute to the HFD-induced deterioration of Alzheimer's disease via a dysfunctional TREM2-related reduction in microglial β-amyloid clearance
实验完整度
高包含体内APP/PS1小鼠模型、体外BV2细胞实验，以及分子对接、BLI、CETSA、IP-MS等多层级验证，明确功能验证和机制验证。
主要模型
APP/PS1转基因小鼠 BV2小胶质细胞
重点核对
HFD喂养6个月，并调整BCAAs含量至200%或50% BV2细胞处理：BCAAs或BCKAs（5 mM）与Aβ（1 μM）共处理4h或12h TREM2与BCAAs/BCKAs结合验证：分子对接、BLI、CETSA、免疫沉淀联合LC-MS/MS TREM2功能抑制剂：S1P、雷帕霉素、氯喹、4-OIC处理 Morris水迷宫、免疫组化、ELISA、Western blot等检测
摘要
高脂饮食（HFD）诱导肥胖和胰岛素抵抗，这可能加剧阿尔茨海默病（AD）进展过程中的淀粉样蛋白-β肽（Aβ）病理。支链氨基酸（BCAAs）在肥胖或胰岛素抵抗患者和动物模型中积累。然而，积累的BCAAs及其代谢物支链酮酸（BCKAs）在HFD诱导的AD恶化中的作用及其潜在机制仍不清楚。在本研究中，APPswe/PSEN1dE9（APP/PS1）转基因小鼠被喂食HFD 6个月，并将HFD中BCAAs含量调整为200%或50%以确定BCAAs的作用。HFD喂养的APP/PS1小鼠在血清和皮层中积累了BCAAs和BCKAs，这伴随着更严重的认知缺陷和AD相关病理。BCAAs的额外摄入或限制摄入分别加重或逆转了这些现象。重要的是，BCAAs和BCKAs在体内和BV2细胞中抑制了小胶质细胞对Aβ的吞噬作用，这可能与触发受体表达于髓系细胞2（TREM2）功能障碍和自噬缺陷有关。我们发现在计算机模拟、纯蛋白溶液和细胞环境中，BCAAs和BCKAs可以结合TREM2。这些分子与Aβ竞争结合TREM2，从而削弱了TREM2对Aβ的反应。此外，BCAAs和BCKAs以不依赖mTOR的方式减少了TREM2的再循环，这也可能导致TREM2功能障碍。我们的发现表明，积累的BCAAs和BCKAs通过功能低下的TREM2介导的小胶质细胞Aβ清除紊乱，促进了HFD诱导的AD进展加速。降低BCAAs和BCKAs水平可能成为AD的潜在饮食干预措施。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探索积累的BCAAs和BCKAs是否以及如何参与HFD诱导的AD恶化，特别是对微胶质细胞Aβ清除功能的影响。
- 核心机制
- BCAAs和BCKAs与TREM2结合，竞争性抑制Aβ与TREM2的结合，导致TREM2功能障碍；同时通过抑制mTOR依赖性自噬和mTOR非依赖性非经典自噬，降低TREM2表达和再循环，从而减少小胶质细胞对Aβ的吞噬，加剧AD病理。
- 主要证据
- APP/PS1小鼠HFD喂养和BCAAs调整实验显示BCAAs积累与认知缺陷和Aβ病理加重相关；BV2细胞实验证实BCAAs/BCKAs抑制Aβ吞噬；分子对接、BLI、CETSA和免疫沉淀验证了BCAAs/BCKAs直接结合TREM2；S1P、雷帕霉素、氯喹和4-OIC处理反转了BCAAs/BCKAs的效应。
- 研究意义
- 该研究揭示了饮食诱导的代谢紊乱与AD进展之间的联系，提示降低BCAAs和BCKAs水平可能作为AD的潜在饮食干预策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估代谢表型和BCAAs积累
验证HFD诱导的胰岛素抵抗和BCAAs代谢异常。
通过OGTT测定糖耐量，通过ELISA测定血清胰岛素水平，通过LC-MS/MS检测血清和皮层中BCAAs和BCKAs浓度。
评估认知功能和AD病理
确定BCAAs积累对认知缺陷和AD病理的影响。
使用Morris水迷宫测试空间学习和记忆能力；通过免疫组化检测Aβ斑块（6E10）、小胶质细胞（IBA1）和突触蛋白表达。
检测小胶质细胞对Aβ吞噬和降解
研究BCAAs/BCKAs对小胶质细胞Aβ清除功能的影响。
使用BV2细胞，荧光标记Aβ，检测吞噬和降解效率。
验证BCAAs/BCKAs与TREM2的结合及对TREM2功能的影响
揭示BCAAs/BCKAs抑制Aβ吞噬的分子机制。
通过分子对接、BLI、CETSA和免疫沉淀-质谱验证直接结合；通过竞争实验、S1P处理、TREM2 recycling assay和Western blot检测下游信号。
研究BCAAs/BCKAs对自噬和TREM2再循环的影响
探讨BCAAs/BCKAs是否通过影响自噬来调控TREM2表达和回收。
使用雷帕霉素、氯喹和4-OIC处理BV2细胞，检测TREM2表达、回收和Aβ吞噬恢复情况。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物饮食 | 标准饮食（A08051501） | Research Diets Inc. | A08051501 |
| 高脂饮食（A06071304） | Research Diets Inc. | A06071304 | |
| 代谢测量 | Accu-Chek Performa血糖仪 | -- | -- |
| 小鼠胰岛素ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnology | -- | |
| LC-MS/MS | Waters ACQUITY UPLC H-Class PLUS系统 | Waters | -- |
| ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18色谱柱 | Agilent Technologies | 95 Å, 3.0×150 mm, 1.8 µm | |
| ELISA | APP和Aβ ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnology | -- |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| 免疫组织化学 | 抗BCAT1抗体（ab232706） | Abcam | ab232706 |
| 抗BCAT2抗体（ab95976） | Abcam | ab95976 | |
| 抗6E10抗体（SIG-39320） | Covance | SIG-39320 | |
| 抗IBA1抗体（ab178846） | Abcam | ab178846 | |
| Axio Observer 7显微镜 | ZEISS | -- | |
| Nikon共聚焦显微镜 | Nikon | -- | |
| RT-qPCR | RNA快速提取试剂盒（组织/细胞） | TIANGEN Biotechnology | -- |
| FastKing反转录试剂盒 | TIANGEN Biotechnology | -- | |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Applied Biosystems 7900HT热循环仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞培养 | BV2细胞 | Servicebio Technology | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 细胞处理 | Aβ1-42 | MedChemExpress | -- |
| 鞘氨醇-1-磷酸（S1P） | MedChemExpress | -- | |
| 雷帕霉素 | MedChemExpress | -- | |
| 氯喹 | MedChemExpress | -- | |
| 4-辛基衣康酸（4-OIC） | MedChemExpress | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂片 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| SDS-PAGE上样缓冲液 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 抗BCKDK抗体（ab111716） | Abcam | ab111716 | |
| 抗磷酸化BCKDH抗体（ab200577） | Abcam | ab200577 | |
| 抗BCKDH抗体（90198） | Cell Signaling Technology | 90198 | |
| 抗突触素抗体（5461） | Cell Signaling Technology | 5461 | |
| 抗PSD95抗体（A7889） | ABclonal Technology | A7889 | |
| 抗BACE1抗体（A5266） | ABclonal Technology | A5266 | |
| 抗TREM2抗体（ab305103） | Abcam | ab305103 | |
| 抗磷酸化Zap-70/SYK抗体（2717） | Cell Signaling Technology | 2717 | |
| 抗SYK抗体（A2123） | ABclonal Technology | A2123 | |
| 抗磷酸化p70 S6激酶抗体（AP0564） | ABclonal Technology | AP0564 | |
| 抗p70 S6激酶抗体（A4898） | ABclonal Technology | A4898 | |
| 抗LC3A/B抗体（12741） | Cell Signaling Technology | 12741 | |
| 抗SQSTM1/P62抗体（A19700） | ABclonal Technology | A19700 | |
| 抗RUBICON抗体（8465） | Cell Signaling Technology | 8465 | |
| 抗GAPDH抗体（ab9485） | Abcam | ab9485 | |
| Aβ吞噬/降解实验 | HiLyte Fluor 488标记的Aβ1-42（AS-60479） | AnaSpec | AS-60479 |
| BeyoGold™白色底透96孔细胞培养板 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 荧光显微镜 | DAPI | -- | -- |
| 分子对接 | TREM2胞外结构域（PDB ID: 6YYE） | RCSB Protein Data Bank | 6YYE |
| Autodock Vina | National Biomedical Computation Resource | -- | |
| Discovery Studio Visualizer | Dassault Systèmes | -- | |
| BLI | ForteBio Octet 96e系统 | SARTORIUS AG | -- |
| 重组人TREM2蛋白 | R&D Systems | -- | |
| 链霉亲和素传感器 | -- | -- | |
| 免疫沉淀 | 免疫沉淀试剂盒（含Protein A+G磁珠） | -- | -- |
| 抗TREM2抗体（ab125117） | Abcam | ab125117 | |
| CETSA | Veriti快速热循环仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系、性别、周龄、饮食配方及持续时间 阅读提示：Materials and methods: Animal model and experimental protocol |
| 代谢评估 | OGTT剂量、采血时间点、检测试剂盒 阅读提示：Materials and methods: Oral glucose tolerance test (OGTT) 和 Metabolic measurements |
| 认知功能测试 | 水迷宫设备尺寸、平台位置、训练天数、每天次数、探针测试时间 阅读提示：Materials and methods: Morris water maze |
| BCAAs和BCKAs检测 | LC-MS/MS方法参数、色谱柱、内标、样品制备 阅读提示：Materials and methods: Amino acids and BCKAs detection by LC‒MS/MS |
| 细胞处理 | BV2细胞培养条件、Aβ聚集方法、药物处理浓度和时间（BCAAs/BCKAs 5 mM，Aβ 1 μM，S1P 40 μM，rapamycin 50 nM，chloroquine 40 μM，4-OIC 40 μM） 阅读提示：Materials and methods: BV2 cell culture and treatments |
| Aβ吞噬和降解实验 | 荧光标记Aβ浓度、处理时间、检测波长、细胞密度 阅读提示：Materials and methods: Aβ phagocytosis and degradation assays |
| TREM2结合验证 | 分子对接软件及参数、BLI实验条件、CETSA温度范围 阅读提示：Materials and methods: Molecular docking, Biolayer interferometry (BLI) assay, Cellular thermal shift assay (CETSA) |
| TREM2再循环实验 | 抗体、pH2.0洗脱条件、回收时间 阅读提示：Materials and methods: TREM2 recycling assay |