体内筛选转移相关细胞
建立高转移潜能的乳腺癌细胞系，用于识别与转移相关的分子变化。
通过原位注射4T1细胞至BALB/c小鼠，分离肺转移（LM）和原发肿瘤（PT）细胞，并通过RNA-seq分析差异通路。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
PRMT1对DDX3的精氨酸甲基化介导线粒体稳态以促进乳腺癌转移
Arginine Methylation of DDX3 by PRMT1 Mediates Mitochondrial Homeostasis to Promote Breast Cancer Metastasis
实验完整度
高研究包含体外细胞实验（功能、修饰、机制）、体内小鼠转移模型（同系和异种移植）以及临床样本组织芯片分析等多个层级，并包含机制验证。
主要模型
4T1小鼠乳腺癌原位转移模型（LM/PT细胞） MDA-MB-231、BT549等三阴性乳腺癌细胞系 BALB/c小鼠和裸鼠异种移植模型 乳腺癌患者配对原发及淋巴结转移组织微阵列
重点核对
PRMT1介导DDX3 R88/R93精氨酸甲基化 DDX3蛋白稳定性受蛋白酶体降解调控（MG132处理） DDX3对PINK1 mRNA的结合和翻译调控（UTR报告基因） 体内转移实验所用的细胞系（4T1或MDA-MB-231）注射剂量和动物品系 DDX3抑制剂RK33的给药剂量及频率
摘要
线粒体动力学和代谢的失调在肿瘤发生中发挥重要作用。转移性肿瘤细胞主要利用线粒体代谢，代谢重编程的调节因子可能为诊断癌症转移提供可靠的生物标志物。在此，我们确定了一个I型精氨酸甲基转移酶–DEAD-box多肽3，X连锁（PRMT1-DDX3）轴，通过协调线粒体生物发生和线粒体自噬以确保线粒体质量控制，从而促进乳腺癌转移。机制上，PRMT1诱导DDX3的精氨酸甲基化，增强其蛋白质稳定性并防止蛋白酶体降解。DDX3通过转位至线粒体，在线粒体应激时促进PTEN诱导激酶1的翻译，从而介导线粒体稳态。抑制DDX3可抑制线粒体生物发生和线粒体自噬，导致癌症干性和转移特性减弱。总体而言，本研究揭示了PRMT1-DDX3轴调节线粒体稳态以支持乳腺癌转移的机制，并提出了针对代谢脆弱性治疗转移性乳腺癌的策略。意义：DDX3通过PRMT1介导的精氨酸甲基化稳定化，并通过上调PINK1协调线粒体自噬和线粒体生物发生，促进乳腺癌进展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PRMT1-DDX3轴是否通过调控线粒体稳态（生物发生与线粒体自噬）促进乳腺癌转移，以及其分子机制。
- 核心机制
- PRMT1催化DDX3 R88/R93位点精氨酸甲基化，增强DDX3蛋白稳定性并抑制其泛素-蛋白酶体降解；在应激下DDX3转位至线粒体，结合PINK1 mRNA的5'和3'UTR，增强PINK1翻译，从而协调线粒体生物发生和线粒体自噬，维持线粒体质量控制，促进肿瘤干性和转移。
- 主要证据
- 体外实验显示PRMT1敲低或抑制降低DDX3蛋白稳定性和线粒体功能；在4T1与MDA-MB-231原位移植模型中，PRMT1或DDX3敲低抑制肿瘤生长和肺/肝转移；患者组织芯片显示PRMT1、DDX3和PINK1在淋巴结转移中高表达，且表达相关。
- 研究意义
- 研究揭示PRMT1-DDX3轴通过线粒体质量控制促进乳腺癌转移的机制，提出其为转移性乳腺癌的诊断标志物和治疗靶点，并提示针对该轴的抑制剂（如DDX3抑制剂RK33）具有治疗潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定PRMT1与DDX3的相互作用及甲基化修饰
验证PRMT1与DDX3在乳腺癌细胞中的结合以及PRMT1对DDX3的精氨酸甲基化作用。
通过免疫共沉淀验证内源和外源相互作用；通过质谱鉴定甲基化位点，并通过突变体验证甲基化对DDX3稳定性的影响。
评估DDX3对线粒体功能与线粒体自噬的影响
确定DDX3在维持线粒体稳态（特别是线粒体自噬和生物发生）中的功能。
通过mt-mKeima荧光、线粒体染料、TEM、mtDNA拷贝数、ATP测定和13C6-葡萄糖示踪等评估线粒体质量、形态和代谢。
分析DDX3对PINK1的调控机制
阐明DDX3如何促进PINK1表达并影响线粒体自噬。
通过RNA免疫沉淀、RNA pull-down和翻译报告实验检测DDX3与PINK1 mRNA的结合及其对翻译的影响；通过共聚焦和亚细胞分离检测DDX3的线粒体转位。
验证DDX3对癌细胞干性和治疗敏感性的影响
研究DDX3介导的线粒体稳态对癌细胞干性、化疗敏感性和转移的影响。
通过肿瘤球形成实验评估干性；MTT实验检测化疗药物敏感性；transwell迁移和侵袭实验。
体内验证PRMT1-DDX3轴对转移的促进作用
在体内模型中验证PRMT1或DDX3敲低对乳腺癌生长和转移的影响。
将4T1和MDA-MB-231敲低细胞原位注射至同系或免疫缺陷小鼠，监测肿瘤生长和转移；使用DDX3抑制剂RK33治疗；对肿瘤组织进行IHC和3D病理成像。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证代谢改变
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning Costar | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Corning Costar | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Corning Costar | -- | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Corning Costar | -- | |
| Glutagro补充剂 | Corning Costar | -- | |
| 病毒包装转导 | 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | H9268 |
| 嘌呤霉素 | Gibco | A1113803 | |
| 质粒转染 | PolyJet体外DNA转染试剂 | SignaGen Laboratories | SL100688 |
| 质粒构建 | pCMV3-Flag-PRMT1质粒 | Sino Biological | -- |
| pCMV3-HA-DDX3质粒 | Sino Biological | -- | |
| pCMV6-AC-GFP载体 | Origene | PS100010 | |
| psiCHECK2-2质粒 | Promega | -- | |
| pHAGE-mt-mKeima质粒 | Addgene | 131626 | |
| pEGFP-LC3质粒 | Addgene | 21073 | |
| 细胞活性检测 | MTT试剂 | BioShop | MTT222 |
| 迁移和侵袭实验 | 基质胶 | Corning | 354234 |
| RNA提取 | GENzol TriRNA纯化试剂盒 | Geneaid | GZX100 |
| RT-qPCR | M-MLV逆转录酶 | Promega | M5313 |
| GoTaq qPCR预混液 | Promega | A6001 | |
| PCRmax ECO48实时荧光定量PCR仪 | PCRmax | -- | |
| Western blot | 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | -- | |
| BioSpectrum成像系统 | UVP | -- | |
| RNA测序 | TruSeq链特异性mRNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
| AMPure XP纯化系统 | Beckman Coulter | -- | |
| Qsep400系统 | Bioptic Inc. | -- | |
| Qubit 2.0荧光计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Illumina NovaSeq 6000平台 | Illumina | -- | |
| 质谱分析 | C18固相萃取柱 | -- | -- |
| 纳升液相色谱-串联质谱（Orbitrap Elite ETD） | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PEAKS studio 10.5软件 | -- | -- | |
| 免疫共沉淀 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 04693132001 |
| 蛋白A/G PLUS-琼脂糖 | Santa Cruz | sc-2003 | |
| 线粒体分离 | 线粒体/胞质分离试剂盒 | Abcam | ab65320 |
| DNA提取 | NucleoSpin组织DNA提取试剂盒 | Macherey-Nagel | 740952 |
| 流式细胞术 | MitoBright LT Red染料 | Dojindo | MT11 |
| JC-1染料 | Dojindo | MT09 | |
| MitoSOX Red染料 | Invitrogen | M36008 | |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC/7-AAD凋亡检测试剂盒 | Elabscience | E-CK-A212 |
| 过氧化氢 | -- | -- | |
| 荧光显微镜 | 含DAPI封片剂 | Santa Cruz | SC-24941 |
| 共聚焦显微镜 | STELLARIS 8共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| 荧光显微镜（Zeiss） | Zeiss | -- | |
| ATP检测 | 糖酵解/氧化磷酸化检测试剂盒 | Dojindo | G270 |
| 寡霉素 | -- | -- | |
| 代谢示踪 | 13C6-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | 389374 |
| 肿瘤球形成 | 表皮生长因子 | GeneScript | Z00333-1 |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Biocompare | 1140-02-10 | |
| B27添加剂 | Gibco | 17504044 | |
| 透射电镜 | HT7700透射电子显微镜 | Hitachi | -- |
| 荧光素酶报告基因 | 荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1500 |
| Renilla-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | E2710 | |
| 体外转录 | EcoRI限制酶 | Thermo Fisher Scientific | FD0274 |
| DNA纯化试剂盒 | Macherey-Nagel | 740727 | |
| T7-FlashScribe转录试剂盒 | Cellscript | C-ASF3507 | |
| RNA纯化试剂盒 | Macherey-Nagel | 740955 | |
| RNA pull-down | Pierce磁珠RNA-蛋白pull-down试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 20164 |
| Pierce RNA 3'末端脱硫生物素化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 20163 | |
| RIP-seq | Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- |
| Qubit 3.0荧光计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Illumina HiSeq/Novaseq测序仪 | Illumina | -- | |
| MGI2000测序仪 | MGI | -- | |
| 免疫组化 | 柠檬酸抗原修复液 | Vector Laboratories | H-3300 |
| Signal Stain Boost免疫组化检测试剂 | Cell Signaling Technology | 8114 | |
| DAB显色试剂盒 | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| 非水溶性封片剂 | Vector Laboratories | H-5000-60 | |
| 3D病理成像 | DiD亲脂性示踪剂 | Thermo Fisher Scientific | D307 |
| DAPI染料 | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 组织透明化试剂 | JelloX Biotech Inc. | -- | |
| FV3000共聚焦显微镜 | Olympus | -- | |
| 肿瘤球形成 | 超低吸附96孔板 | Corning Costar | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（ATCC），培养基（DMEM或RPMI-1640）及添加物浓度（10% FBS、1%青霉素-链霉素等）。 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture |
| DDX3敲低与过表达 | shRNA靶序列（详见补充表S1），慢病毒包装所用细胞（HEK293T）和包装质粒（pMDG、Δ8.9），感染时聚凝胺浓度（5 µg/mL）和筛选药物嘌呤霉素浓度（2 µg/mL）。 阅读提示：Materials and Methods: Viral infection for stable cell line establishment |
| 线粒体自噬检测 | mt-mKeima报告基因、CCCP浓度（10 µmol/L）和处理时间（6小时），线粒体染料（MitoBright LT Red、JC-1、MitoSOX Red）浓度（50 nmol/L）和孵育时间（30分钟）。 阅读提示：Materials and Methods: Visualization of mitochondrial features and Flow cytometry |
| PINK1翻译调控 | psiCHECK2-PINK1 5'UTR/3'UTR报告质粒转染量（500 ng/well），DDX3突变体质粒转染量（3,000 ng/well），放线菌素D浓度（20 μg/mL）处理时间（未明确指出，但用于mRNA稳定性检测）。 阅读提示：Materials and Methods: Translational reporter assays and RNA stability |
| 体内转移实验 | 小鼠品系（BALB/c、BALB/c nude）、细胞数量（4T1 2×10^5或MDA-MB-231 2×10^6）、注射部位（乳腺脂肪垫）、RK33剂量（20 mg/kg）和给药频率（每周三次）。 阅读提示：Materials and Methods: Animal studies |