嗜酸性慢性鼻窦炎伴鼻息肉小鼠模型诱导神经炎症和嗅觉功能障碍

Murine model of eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyposis inducing neuroinflammation and olfactory dysfunction

作者信息Wei-Hao Huang, Yu-Wen Hung, Wei Hung, Ming-Ying Lan, Chien-Fu Yeh
PMID38494093
发布时间2024-08
DOI10.1016/j.jaci.2024.02.021

实验完整度

高

包含组织学、细胞因子检测、行为学、基因表达等多层级验证,并包含功能与机制验证。

主要模型

BALB/c小鼠ECRSwNP模型 小鼠嗅球组织 小鼠鼻腔黏膜

重点核对

OVA和AP的给药剂量(低剂量0.5 U,高剂量2 U) 给药时间(6周和12周) 小鼠品系(雄性BALB/c) 行为学测试类型(埋藏食物测试、嗅觉习惯化/去习惯化测试) 检测指标(OMP、MPO、细胞因子等)

摘要

背景:慢性鼻窦炎(CRS)是一种影响鼻腔和鼻旁窦黏膜的常见炎症性疾病,常伴有嗅觉功能障碍。嗜酸性CRS伴鼻息肉(ECRSwNP)是CRS的一种亚型,以嗜酸性粒细胞浸润为特征。伴有嗅觉功能障碍的ECRSwNP动物模型对于探索潜在的治疗策略是必要的。目的:本研究旨在通过鼻内给予卵清蛋白和曲霉蛋白酶(AP),在更短的时间内建立伴有嗅觉功能障碍的ECRSwNP小鼠模型。通过评估鼻窦炎症、细胞因子水平、嗅觉功能和嗅球神经炎症来验证模型的有效性。方法:雄性BALB/c小鼠鼻内给予卵清蛋白和AP,持续6周和12周,以诱导ECRSwNP。所得ECRSwNP小鼠模型进行了组织学评估、鼻灌洗液细胞因子分析、嗅觉行为测试和基因表达谱分析,以识别嗅球内的神经炎症标志物。结果:所开发的小鼠模型表现出大量嗜酸性粒细胞浸润、鼻灌洗液中炎性细胞因子水平升高,并通过行为学实验证实了嗅觉功能障碍。此外,在模型中观察到嗅球炎症和成熟嗅觉感觉神经元减少。结论:本研究成功地在仅6周的短时间内建立了经验证的伴有嗅觉功能障碍的ECRSwNP小鼠模型,为研究该疾病的发病机制和潜在治疗方法提供了有价值的工具。该模型为未来CRS伴鼻息肉和嗅觉功能障碍的研究提供了一种高效的方法。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
如何建立伴有嗅觉功能障碍的ECRSwNP小鼠模型,并验证其神经炎症与嗅觉功能障碍的关系?
核心机制
OVA/AP诱导的鼻腔炎症可能通过激活嗅球小胶质细胞和增加炎症因子,导致成熟嗅觉感觉神经元减少,进而引起嗅觉功能障碍。
主要证据
模型小鼠显示嗜酸性粒细胞浸润、炎症因子升高、嗅觉行为测试异常、嗅球炎症标志物(MCP-1、CD68、Iba1)和炎症因子(TNF-α、IL-1β)表达升高,且OMP阳性区域减少并与埋藏食物测试潜伏期呈负相关。
研究意义
该模型为研究ECRSwNP的发病机制和潜在治疗策略提供了高效的工具,尤其有助于探索神经炎症相关方面。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立ECRSwNP小鼠模型

通过鼻内给予OVA和AP诱导ECRSwNP模型,并缩短建模时间。

雄性BALB/c小鼠适应1周后,每周3次鼻内给予含75 μg OVA和AP(低剂量0.5 U或高剂量2 U)的20 μL PBS,持续6周或12周;对照组给予PBS。

2

组织学评估

评估鼻窦黏膜炎症、息肉样病变及上皮厚度变化。

处死小鼠后取头,固定脱钙,石蜡切片,进行HE染色评估息肉样病变和上皮厚度,免疫组化检测BMK-13和MPO以计数嗜酸性粒细胞和中性粒细胞,OMP染色评估嗅觉上皮厚度。

3

鼻灌洗液细胞因子分析

检测鼻灌洗液中炎症细胞因子水平,反映鼻腔炎症状态。

麻醉后行气管切开,22G导管插入后鼻孔,用1 mL PBS灌洗鼻腔,收集灌洗液,离心后用多重免疫测定法检测IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-17A、eotaxin和TNF-α。

4

嗅觉行为测试

评估小鼠嗅觉功能,包括嗅觉敏感性和辨别能力。

在OVA/AP给药12周后,进行埋藏食物测试和嗅觉习惯化/去习惯化测试。埋藏食物测试:小鼠禁食20小时,记录找到并开始吃埋藏食物的潜伏期;暴露食物测试作为对照。嗅觉习惯化/去习惯化测试:依次呈现水、香蕉、杏仁和两种社会气味,记录每次嗅探时间。

5

嗅球基因表达分析

检测嗅球中炎症标志物和神经元标志物的mRNA水平,评估神经炎症。

给药12周后,收集嗅球组织,提取总RNA,逆转录合成cDNA,RT-qPCR检测MCP-1、CD68、Iba1、TNF-α、IL-1β、iNOS、IFN-γ、OMP、GAP43、AC3和NeuN的相对表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
卵清蛋白Sigma-Aldrich--
抗嗜酸性粒细胞主要碱性蛋白抗体Novus BiologicalsNBP1-42140
嗜酸性粒细胞-肥大细胞染色试剂盒ScyTek Laboratories--
抗髓过氧化物酶抗体ElabscienceE-AB-70091
抗嗅觉标记蛋白抗体Abcamab183947
ProcartaPlex多重免疫测定Invitrogen--
实验室可高压灭菌啮齿动物饲料5010LabDiet--
SYBR green PCR预混液Vazyme Biotech--
SPSS 17.0IBM--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型建立
小鼠品系(雄性BALB/c)、年龄、体重、给药剂量(OVA 75 μg,AP 0.5或2 U)、给药体积(20 μL)、给药频率(每周3次)、持续时间(6或12周)
阅读提示:Methods: Animals, Establishment of ECRSwNP model
组织学评估
切片位置(眼前缘前部)、切片厚度(4 μm)、染色方法(HE、BMK-13、MPO、OMP)、息肉定义
阅读提示:Methods: Histologic evaluation, Fig 1-4
鼻灌洗液细胞因子分析
灌洗液体积(1 mL)、检测方法(ProcartaPlex多重免疫测定)、细胞因子种类
阅读提示:Methods: Nasal lavage fluid cytokine analysis
行为学测试
埋藏食物测试的禁食时间(20小时)、潜伏期记录方法;嗅觉习惯化/去习惯化测试的气味种类、呈现次数和时长
阅读提示:Methods: Olfactory behavior test, Fig 6
嗅球基因表达分析
给药时间(12周)、嗅球组织收集、内参基因(GAPDH)、分析方法(2^-ΔΔCt)
阅读提示:Methods: Measurement of the mRNA of proinflammatory mediators and neuronal markers..., Fig 8