TET3在KCs中的表达验证
验证TET3在Kupffer细胞中的高表达，并确认其与M2极化的相关性。
通过Human Protein Atlas和TISCH数据库预测TET3分布，分离KCs并通过流式细胞术确认CD68阳性率，RT-qPCR和Western blot检测TET3表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
ZMIZ1上调TET3介导的羟甲基化通过介导Notch1/c-Myc信号诱导肝细胞癌发生中Kupffer细胞的M2极化
ZMIZ1 Upregulation of TET3-Mediated Hydroxymethylation Induces M2 Polarization of Kupffer Cells in Hepatocellular Carcinogenesis by Mediating Notch1/c-Myc Signaling
实验完整度
高包含体外细胞共培养、体内异种移植瘤模型、临床样本分析及多种分子机制验证（如ChIP、Co-IP、荧光素酶报告基因等），证据层级多样。
主要模型
Kupffer细胞 Huh-7细胞 SNU-423细胞 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型
重点核对
KCs经20 ng/mL IL-10刺激诱导M2极化 sh-TET3或sh-ZMIZ1慢病毒载体感染KCs，并以嘌呤霉素筛选 KCs与HCC细胞共培养72小时 体内实验中，每只小鼠注射1×10^5个KCs和4×10^5个Huh-7细胞 使用sh-TET3-1#和sh-TET3-2#进行体外实验，体内实验仅用sh-TET3-1#
摘要
DNA羟甲基化由ten-eleven translocation（TET）家族甲基胞嘧啶双加氧酶介导，是一种重要的表观遗传修饰，在众多生物过程中调控基因表达。本研究关注TET3对Kupffer细胞（KCs）极化的影响及其与肝细胞癌（HCC）发展的联系。研究发现TET3在KCs中丰富表达，其敲低诱导M2-M1表型转变，导致共培养的HCC细胞活力、迁移和侵袭受到抑制。此外，TET3敲低抑制了裸鼠中HCC细胞的肿瘤发生。通过生物信息学预测了TET3的下游靶标。TET3介导的DNA羟甲基化作用于锌指MIZ型包含1（ZMIZ1）启动子。ZMIZ1蛋白与Notch受体1（Notch1）蛋白相互作用，激活c-Myc的转录。在KCs中沉默ZMIZ1同样抑制了KCs的M2极化和共培养HCC细胞的恶性表型。然而，这些变化被KCs中Notch1或c-Myc的过表达所抵消。总之，本研究表明TET3介导的ZMIZ1羟甲基化通过Notch1/c-Myc轴促进KCs的M2极化，从而增强肝细胞癌的发生。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TET3是否通过调控Kupffer细胞极化影响肝细胞癌的发生发展？
- 核心机制
- TET3介导ZMIZ1启动子羟甲基化，上调ZMIZ1表达，ZMIZ1与Notch1相互作用激活c-Myc转录，促进KCs的M2极化，进而增强HCC恶性表型。
- 主要证据
- 体外细胞共培养实验显示TET3敲低抑制HCC细胞活力、迁移和侵袭；体内异种移植瘤实验显示TET3敲低抑制肿瘤生长；分子实验证实TET3结合ZMIZ1启动子并调控其羟甲基化，ZMIZ1与Notch1相互作用，Notch1结合c-Myc启动子并增强其转录活性。
- 研究意义
- 本研究揭示了TET3-ZMIZ1-Notch1/c-Myc轴在HCC中通过调控KCs M2极化促进肿瘤进展的新机制，提示抑制TET3或ZMIZ1可能阻断M2极化并抑制HCC恶性发展。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TET3对KCs M2极化的影响
评估TET3敲低对KCs M2极化的影响及其对共培养HCC细胞恶性行为的作用。
用sh-TET3慢病毒感染KCs，通过ELISA检测细胞因子（IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β），流式细胞术检测CD206+细胞比例，并与Huh-7或SNU-423共培养后检测HCC细胞活力、迁移和侵袭。
TET3敲低对体内肿瘤形成的影响
在体内验证TET3敲低对HCC肿瘤生长的抑制作用。
将sh-TET3感染的KCs与Huh-7细胞混合注射入裸鼠皮下，监测肿瘤体积和重量，并通过免疫组化和流式检测肿瘤组织中的KI67和CD206表达。
TET3下游靶标预测和验证
预测并验证TET3的下游靶标，重点关注ZMIZ1。
分析GEO数据集GSE39186和UALCAN数据库，筛选与TET3相关的基因，交叉得到15个基因，通过TISCH数据库选出ZMIZ1，并验证其在临床样本和KCs中的表达。
TET3对ZMIZ1启动子羟甲基化的调控
验证TET3是否通过DNA羟甲基化修饰调控ZMIZ1表达。
在KCs中敲低TET3后，通过ChIP-qPCR检测TET3与ZMIZ1启动子的结合，通过亚硫酸盐测序检测启动子甲基化水平，通过葡萄糖基化DNA和甲基化敏感qPCR检测羟甲基化水平。
ZMIZ1对KCs M2极化和HCC细胞恶性表型的影响
验证ZMIZ1过表达是否逆转TET3敲低导致的M2极化抑制和HCC细胞恶性表型降低。
在sh-TET3的KCs中过表达ZMIZ1，检测细胞因子、CD206+比例，共培养HCC细胞检测活力、迁移、侵袭，并利用异种移植瘤模型验证体内效应。
ZMIZ1对Notch1/c-Myc信号通路的激活
验证ZMIZ1是否通过Notch1/c-Myc通路发挥作用。
通过Co-IP验证ZMIZ1与Notch1相互作用，ChIP-qPCR检测Notch1与c-Myc启动子结合，双荧光素酶报告基因检测c-Myc启动子活性，并在sh-ZMIZ1基础上过表达Notch1或c-Myc观察恢复效应。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 白细胞介素-10 | -- | -- | |
| 细胞感染 | 慢病毒载体 | VectorBuilder Inc | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| PrimeScript RT试剂盒 | Takara Biotechnology Ltd | -- | |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | -- | |
| LightCycler 480实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| ELISA | 人IL-10 ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnologies | E-EL-H6154 |
| 人TGF-β1 ELISA试剂盒 | BioVision | K4342 | |
| 人IL-12 ELISA试剂盒 | BioVision | K4226 | |
| 人IL-6 ELISA试剂盒 | BioVision | K4143 | |
| 人TNF-α ELISA试剂盒 | Bio-Techne | HSTA00E | |
| 小鼠IL-10 ELISA试剂盒 | R&D Systems | M1000B | |
| 小鼠TGF-β1 ELISA试剂盒 | BioVision | K4343 | |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | BMS603HS | |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | R&D Systems | MHSTA50 | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| BCA蛋白浓度测定试剂盒 | -- | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| ZMIZ1抗体 | Cell Signaling Technology | 89500S | |
| c-Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 18583S | |
| Notch1抗体 | Abcam | ab52627 | |
| GAPDH抗体 | Abcam | ab9485 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | ABclonal Technology | AS014 | |
| 增强化学发光试剂盒 | ABclonal Technology | RM00021 | |
| UVP成像系统 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| Co-immunoprecipitation | 蛋白A/G琼脂糖珠 | -- | -- |
| 免疫共沉淀 | ZMIZ1抗体 | CST | 89500S |
| Notch1抗体 | CST | 3608S | |
| IgG抗体 | CST | 3900S | |
| 染色质免疫沉淀 | SimpleChIP Plus超声染色质IP试剂盒 | CST | 56383 |
| TET3抗体 | CST | 99980S | |
| Notch1抗体 | CST | 3608S | |
| IgG抗体 | CST | 3900S | |
| 双荧光素酶报告基因 | pGL3质粒 | Promega Corporation | -- |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 双荧光素酶系统 | Promega | -- | |
| 甲基化特异性PCR | QIAamp DNA微型试剂盒 | Qiagen GmbH | 51304 |
| 甲基化敏感性qPCR | EpiMark 5-hmC和5-mC分析试剂盒 | New England Biolabs Ltd | E3317S |
| 流式细胞术 | CD68磁珠 | -- | -- |
| FITC-CD68抗体 | Abcam | ab134351 | |
| PE-CD206抗体 | Thermo Fisher Scientific | 12-2061-82 | |
| FACS Aria II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-730 | |
| 红细胞裂解液 | Miltenyi Biotec | 130-094-183 | |
| CD16/32抗体 | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-81 | |
| 免疫组织化学 | KI67抗体 | GeneTex Inc | GTX16667 |
| CD206抗体 | Abcam | ab64693 | |
| 山羊抗兔IgG | GeneTex | GTX213110-01 | |
| 细胞培养 | Huh-7细胞系 | Procell Life Science & Technology | CL-0120 |
| SNU-423细胞系 | American Type Culture Collection | CRL-2238 | |
| THLE-2细胞系 | American Type Culture Collection | CRL-2706 | |
| THLE-3细胞系 | American Type Culture Collection | CRL-11233 | |
| 统计分析 | GraphPad Prism软件 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| KCs分离与培养 | KCs来源、培养条件（DMEM、10% FBS、1%抗生素），IL-10刺激浓度（20 ng/mL）和时间（24小时） 阅读提示：Methods - Cells |
| 基因敲低/过表达 | 慢病毒载体类型（shRNA或OE），感染时间（48小时），筛选药物（嘌呤霉素）及浓度 阅读提示：Methods - Cell Infection |
| 共培养实验 | Transwell孔径，KCs和HCC细胞接种数量，共培养时间（72小时） 阅读提示：Methods - Coculture of Kupffer Cells With Hepatocellular Carcinoma Cells |
| 体内肿瘤模型 | 小鼠品系、性别、年龄、体重，细胞注射数量（KCs 1×10^5，Huh-7 4×10^5），注射部位（右胁），肿瘤测量时间（每周），实验周期（5周） 阅读提示：Methods - Animals |
| 分子机制验证 | 抗体信息（ZMIZ1、Notch1、TET3等），ChIP实验的固定条件、抗体用量、洗涤条件，Co-IP实验的裂解条件、免疫沉淀时间，荧光素酶报告基因的转染试剂和方法 阅读提示：Methods - Western Blot Analysis, Co-immunoprecipitation, Chromatin Immunoprecipitation, Dual Luciferase Reporter Assay |