建立原位胰腺癌小鼠模型
在免疫活性小鼠中建立反映胰腺癌特征的肿瘤模型,用于评估治疗效果。
将Panc-02细胞(106细胞/50µL PBS)或KPC细胞(105细胞/50µL PBS)原位注射到小鼠胰腺中,分别形成原位Panc-02和KPC模型;另在裸鼠中建立原位Panc-02模型。
Nicotinamide combined with gemcitabine is an immunomodulatory therapy that restrains pancreatic cancer in mice
包含原位Panc-02和KPC小鼠模型、裸鼠模型、T细胞体内耗竭、流式、IHC、ELISPOT、Nanostring和RNAscope等多层级验证,且包含功能验证和机制探索。
原位Panc-02小鼠胰腺癌模型 原位KPC小鼠胰腺癌模型 原位Panc-02裸鼠模型
Panc-02细胞注射剂量:106细胞/50µL PBS KPC细胞注射剂量:105细胞/50µL PBS NAM给药剂量:20 mg/200µL/剂,口服 GEM给药剂量:1.2 mg/200µL/剂,腹腔注射 治疗周期:肿瘤注射后10天开始,隔天交替给药,持续2周
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
在免疫活性小鼠中建立反映胰腺癌特征的肿瘤模型,用于评估治疗效果。
将Panc-02细胞(106细胞/50µL PBS)或KPC细胞(105细胞/50µL PBS)原位注射到小鼠胰腺中,分别形成原位Panc-02和KPC模型;另在裸鼠中建立原位Panc-02模型。
评估NAM和GEM交替给药对肿瘤生长、转移和生存期的影响。
在肿瘤注射后10天开始治疗,NAM(20 mg/200µL/剂)口服,GEM(1.2 mg/200µL/剂)腹腔注射,隔天交替,持续2周。
量化肿瘤重量、转移数量和腹水等级,并进行生存分析。
治疗结束后测量肿瘤重量、计数转移灶、评估腹水等级;生存研究中监测小鼠至死亡或达到人道终点。
检测治疗对肿瘤内免疫细胞亚群(T细胞、TAM、MDSC)的影响。
用胶原酶和分散酶消化肿瘤组织,获得单细胞悬液,通过流式细胞术分析CD45+、CD4+、CD8+、TAM和MDSC;并用免疫组织化学(IHC)验证CD4和CD8 T细胞的数量及颗粒酶B和穿孔素的表达。
评估治疗是否诱导针对肿瘤相关抗原survivin的T细胞反应。
分离脾细胞,用survivin质粒转染进行ELISPOT检测,并通过磁珠分选去除CD4或CD8 T细胞来确定产生IFNγ的细胞亚群。
确定CD4和CD8 T细胞在NAM+GEM治疗抗肿瘤效应中的相对贡献。
在NAM+GEM治疗期间,给荷瘤小鼠注射抗CD4或抗CD8抗体(或同型对照),比较肿瘤重量和转移数量。
观察治疗对肿瘤基质成分(胶原蛋白I、HABP、αSMA、CD31)及淋巴结样结构的影响。
通过Masson三色染色检测胶原蛋白I,RT-PCR检测HABP表达,IHC检测αSMA和CD31,并观察肿瘤周围和内部的淋巴结样结构。
识别NAM+GEM治疗引起的与免疫反应和肿瘤进展相关的基因表达变化。
提取肿瘤RNA,使用nCounter PanCancer Immune Profiling Panel(Nanostring)对770个免疫相关基因进行表达定量,并用RNAscope验证关键基因(Ccl21a和Fcer1a)的表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | McCoy's 5A培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| 胎牛血清 | 文中未明确说明 | -- | |
| L-谷氨酰胺 | 文中未明确说明 | -- | |
| 非必需氨基酸 | 文中未明确说明 | -- | |
| 青霉素/链霉素 | 文中未明确说明 | -- | |
| 肿瘤消化 | 分散酶 | Roche | 049422078001 |
| 胶原酶 | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| 流式分析 | 抗CD3抗体 | BD Bioscience | 560527 |
| 抗CD8抗体 | BD Bioscience | 552877 | |
| 抗CD4抗体 | BD Bioscience | 552051 | |
| 抗CD11b抗体 | BD Bioscience | 553312 | |
| 抗Gr1抗体 | BD Bioscience | 553127 | |
| 抗F4/80抗体 | eBioscience | 17-4801-82 | |
| 可固定蓝色或绿色活/死细胞染色试剂盒 | BD Bioscience | 564406 | |
| LSR-II流式细胞仪 | Beckton and Dickinson | -- | |
| FlowJo V.7.6软件 | FlowJo | -- | |
| ELISPOT | 酶联免疫斑点试剂盒 | BD Biosciences | 551083 |
| pcDNA-3.1-survivin质粒 | 文中未明确说明 | -- | |
| pCDNA3.1空白载体 | 文中未明确说明 | -- | |
| CTL Immunospot S4分析仪 | CTL | -- | |
| 磁珠去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 免疫组化(IHC) | 抗CD4抗体 | Cell Signaling Technology | 25229 |
| 抗CD8α抗体 | Cell Signaling Technology | 98941 | |
| 抗穿孔素抗体 | Cell Signaling Technology | 31647 | |
| 抗颗粒酶B抗体 | Cell Signaling Technology | 44153 | |
| 抗CD31抗体 | Cell Signaling Technology | 77699 | |
| 抗α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)抗体 | Cell Signaling Technology | 19245 | |
| SignalStain Boost免疫组化检测试剂 | Cell Signaling Technology | 8114S | |
| 3D Histech P250高容量玻片扫描仪 | 3D Histech | -- | |
| 体内T细胞耗竭 | 抗CD4抗体(克隆GK1.5) | BioXCell | BE0003-1 |
| 抗CD8抗体(克隆YTS169.4) | BioXCell | BE0117 | |
| 同型对照抗体(克隆LTF-2) | BioXCell | BE0090 | |
| RNA提取 | RNA稳定液 | Invitrogen | -- |
| TRIzol | Life Technologies | -- | |
| RNA质量控制 | NanoDrop 2000微量分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 基因表达分析 | nCounter小鼠泛癌免疫分析面板 | NanoString | -- |
| RNAscope | RNAScope 2.5 HD检测试剂盒(红色) | ACD Bio-Techne | -- |
| Ccl21a探针 | ACD Bio-Techne | 489921 | |
| Fcer1a探针 | ACD Bio-Techne | 886381 | |
| Aperio CS2扫描仪 | Leica Biosystems | -- | |
| HALO图像分析软件 | Indica Labs | -- | |
| EVOS M7000成像系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系、年龄、性别、细胞注射数量、注射体积、注射部位(胰腺)、肿瘤可触及时间 阅读提示:Methods中的Animals、Cell lines、Mouse models |
| 药物治疗 | NAM剂量(20 mg/200µL/剂)、GEM剂量(1.2 mg/200µL/剂)、给药途径(口服、腹腔)、给药频率(隔天交替)、治疗持续时间(2周)、治疗起始时间(肿瘤注射后10天) 阅读提示:Methods中的Protocol for treatment of mice with NAM+GEM |
| 疗效评估 | 肿瘤重量测量、转移计数、腹水等级评分标准、生存分析终点标准、每组动物数(n=10) 阅读提示:Results部分和图1图注 |
| 免疫细胞分析 | 肿瘤消化酶浓度(Dispase和Collagenase)、流式抗体克隆、细胞获取数量、分析软件设置、IHC抗体稀释度、视野数及定量方法 阅读提示:Methods中的Flow cytometry、Immunohistochemistry,图2图注 |
| T细胞功能分析 | ELISPOT检测的脾细胞数量、survivin质粒和对照质粒、刺激时间、磁珠分选去除非CD4/CD8细胞、使用试剂盒 阅读提示:Methods中的Elispot,图2M图注 |
| 体内T细胞耗竭 | 抗体剂量(300µg)、注射间隔(每3天)、注射次数(5次)、抗体克隆(GK1.5和YTS169.4)、对照抗体 阅读提示:Methods中的CD4 and CD8 T cell depletions in vivo,图3图注 |
| 基因表达分析 | RNA提取方法、RNA质量指标(OD260/280、RIN)、Nanostring面板型号、数据标准化方法、差异表达阈值(调整p<0.01,倍数变化>2) 阅读提示:Methods中的Nanostring technology、Bioinformatics analysis、Statistical analysis Nanostring |