B7-H3表达验证及CAR T细胞制备
确认DIPG模型上B7-H3高表达，并制备功能性B7-H3 CAR T细胞。
通过流式细胞术量化B7-H3表面密度；从健康供体PBMC中分离T细胞，用抗CD3/CD28磁珠激活，并用慢病毒转导生产CAR T细胞。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
B7-H3 CAR T细胞与ONC206组合对弥漫性内生性脑桥胶质瘤的临床前疗效
Preclinical efficacy of combinatorial B7-H3 CAR T cells and ONC206 against diffuse intrinsic pontine glioma
实验完整度
高包含体外细胞实验、代谢分析、转录组测序、体内原位异种移植模型等多个独立证据层级，并进行了功能验证（细胞毒性、凋亡）和机制验证（线粒体功能障碍、凋亡通路）。
主要模型
患者来源DIPG细胞培养（PBT-22FH、PBT-24FH、PBT-27FH、PBT-29FH、SU-DIPG-XIII） 原位异种移植小鼠模型（SU-DIPG-XIII和PBT-29FH） 健康供体来源的B7-H3 CAR T细胞
重点核对
B7-H3 CAR T细胞的效应靶比（E:T）为1:10、1:4、1:2、1:1、2:1、5:1 ONC206浓度：IC50范围217-298 nM，联合实验使用约250 nM 体内给药：ONC206口服剂量50 mg/kg，每周两次；CAR T细胞单次脑室内注射（SU-DIPG-XIII模型1×10^6细胞，PBT-29FH模型2.5×10^5细胞） 体内模型：NSG小鼠，SU-DIPG-XIII注射5×10^4细胞，PBT-29FH植入肿瘤碎片
摘要
背景：弥漫性内生性脑桥胶质瘤（DIPG）是一种致命的小儿脑肿瘤，在美国每年影响超过300名儿童。嵌合抗原受体（CAR）T细胞是一种针对血液系统癌症具有显著临床获益的靶向免疫效应细胞疗法。针对中枢神经系统（CNS）肿瘤，靶向B7-H3（在DIPG上高表达的蛋白）的CAR T细胞已从临床前研究迅速推进到临床试验。BrainChild-03（NCT04185038）是重复脑室内（ICV）递送B7-H3靶向CAR T细胞（B7-H3 CAR T细胞）的1期试验，显示了DIPG儿童和年轻成人患者的耐受性和潜在疗效。然而，临床获益并不一致，针对如此侵袭性的疾病可能需要多药联合治疗策略。在此，我们将B7-H3 CAR T细胞与同样处于临床研究阶段的咪普利酮分子ONC206联合使用。方法：我们在多种DIPG细胞培养物和原位异种移植小鼠模型中测试了B7-H3 CAR T细胞与ONC206的联合作用。结果：B7-H3 CAR T细胞单药治疗诱导了强烈的细胞毒性，而ONC206治疗导致DIPG细胞显著的线粒体功能障碍。低效靶比的B7-H3 CAR T细胞与IC50浓度的ONC206联合在体外导致细胞毒性显著增强（P < .003），并增加了IL-2、IL-29、VEGF-A和颗粒酶B的水平。体内联合研究中，ONC206与单次ICV剂量的B7-H3 CAR T细胞联合延长了DIPG异种移植小鼠模型的生存期。结论：B7-H3 CAR T细胞与ONC206联合是针对多种DIPG模型的可行且有效的多药联合方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- B7-H3 CAR T细胞与ONC206联合是否能增强对弥漫性内生性脑桥胶质瘤（DIPG）的抗肿瘤疗效，且不影响CAR T细胞功能？
- 核心机制
- ONC206诱导肿瘤细胞线粒体功能障碍和凋亡，增强肿瘤对免疫介导杀伤的敏感性；同时不损害CAR T细胞的代谢适应性、表型和效应功能，从而产生协同抗肿瘤效应。
- 主要证据
- 体外实验显示联合治疗显著增强细胞毒性并增加IL-2、IL-29、VEGF-A和颗粒酶B水平；体内实验显示联合治疗延长原位DIPG小鼠模型的生存期，且未观察到明显毒性。
- 研究意义
- 该研究首次评估ONC206与CAR T细胞联合，为DIPG及其他B7-H3表达阳性的高级别脑和脊髓肿瘤的多药联合免疫治疗提供了临床转化的策略和临床前依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
药物筛选与ONC206选择
从多种药物中筛选出与CAR T细胞兼容且有抗DIPG活性的候选药物。
对9种药物（包括ONC206）测定DIPG细胞IC50，并评估它们对激活后CAR T细胞增殖的影响。
ONC206单药效应评估
评估ONC206对DIPG细胞的凋亡、代谢和转录组影响。
通过Annexin-V、Caspase-3/7活性、Seahorse代谢分析和RNA-seq评估ONC206的作用。
联合治疗体外验证
验证低剂量ONC206与低效靶比CAR T细胞联合是否能增强细胞毒性，并评估对CAR T细胞功能的影响。
使用活细胞成像和生物发光测定评估联合细胞毒性；通过流式细胞术分析T细胞亚群和耗竭标志物；通过多因子检测分析细胞因子分泌；通过SynergyFinder分析协同效应。
体内联合治疗验证
在两种原位DIPG小鼠模型中验证联合治疗的疗效和耐受性。
建立SU-DIPG-XIII和PBT-29FH原位模型，分别给予ONC206和/或CAR T细胞，监测生存期和体重。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | NeuroCult NS-A基础培养基 | Stemcell Technologies | -- |
| 表皮生长因子 | PeproTech | -- | |
| 成纤维细胞生长因子 | PeproTech | -- | |
| GlutaMax添加剂 | Gibco | -- | |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Thermofisher | -- | |
| 慢病毒生产 | psPAX2包装质粒 | -- | -- |
| pVSV-G包膜质粒 | -- | -- | |
| CAR T细胞制备 | EasySep分离试剂盒 | -- | -- |
| 抗CD3/CD28 Dynabeads磁珠 | -- | -- | |
| CryoStor CS10冻存液 | -- | -- | |
| 生物发光存活测定 | D-荧光素 | -- | -- |
| 活细胞成像 | Incucyte S3活细胞成像系统 | Sartorius | -- |
| 流式分析 | FITC标记的Annexin-V抗体 | -- | -- |
| Cytoflex流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 代谢分析 | Seahorse XFe96分析仪 | Agilent | -- |
| 细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent | -- | |
| XF基础培养基 | Agilent | -- | |
| 寡霉素 | -- | -- | |
| FCCP（解偶联剂） | -- | -- | |
| 流式分析 | Quantibrite PE微球 | BD | -- |
| eBioscience Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | Thermo Fisher | -- | |
| RNA测序 | RNeasy Plus Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| 药物处理 | ONC206 | Chimerix | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | DIPG细胞培养基成分（NeuroCult NS-A + Supplement）、EGF和FGF浓度（40 ng/mL）、GlutaMax浓度（2 mM）；Lenti-X 293T细胞培养条件 阅读提示：Methods: Human Specimen and Patient-Derived Cell Cultures |
| CAR T细胞制备 | PBMC来源（健康供体）、分离方法（负选）、刺激时间（36小时）、MOI（5）、细胞密度（0.8e6/mL）、细胞因子浓度（IL-7 5 ng/mL, IL-15 0.5 ng/mL） 阅读提示：Methods: CAR T Cell Manufacturing |
| 体外联合杀伤实验 | E:T比（1:10至1:4）、ONC206浓度（约250 nM）、处理时间（7天成像，5天细胞因子）、肿瘤细胞起始数（5000） 阅读提示：Results: Increased Cytotoxicity...; Methods: Bioluminescence Survival Assays, Live-Imaging Cytotoxicity Assays |
| 代谢分析（Seahorse） | ONC206处理浓度（150-300 nM）、处理时间（48小时）、细胞起始数、线粒体压力测试药物浓度（oligomycin 2 μM, FCCP 2 μM, rotenone/antimycin A 0.5 μM） 阅读提示：Methods: Seahorse Assays |
| 体内动物实验 | 小鼠品系（NSG）、性别（雌性）、年龄（8周）、肿瘤细胞注射数量（SU-DIPG-XIII: 5e4; PBT-29FH: 肿瘤碎片）、CAR T细胞剂量（SU-DIPG-XIII: 1e6 ICV; PBT-29FH: 2.5e5 ICV）、ONC206剂量（50 mg/kg，口服，每周两次）、治疗时间（SU-DIPG-XIII: CAR T第7天；PBT-29FH: CAR T第10天） 阅读提示：Methods: Surgical Procedure and in Vivo Experimentation; Figure 6 |