circRNA合成与鉴定
利用I型内含子自剪接系统合成编码EGFP或anti-DLL3 CAR的circRNA，并验证其闭环结构和蛋白翻译能力。
构建含T7启动子、GOI、CVB3 IRES、PIE构件的质粒，IVT合成circRNA，RNase R处理、琼脂糖凝胶电泳、Sanger测序验证环化，转染293T和H1299细胞评估蛋白表达。
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基于工程化环状RNA的DLL3靶向CAR-T疗法用于小细胞肺癌
Engineered circular RNA-based DLL3-targeted CAR-T therapy for small cell lung cancer
实验完整度
中研究包含体外细胞实验、流式细胞术、细胞毒性实验和体内皮下及原位小鼠模型，但缺乏类器官或患者来源异种移植模型等更接近临床的验证层级，且未设置病毒载体CAR-T对照，整体证据层级为体外与体内模型结合。
主要模型
人原代CD3+ T细胞 DLL3阳性SCLC细胞系（SHP-77、H69、H524） 皮下SCLC小鼠模型（NCG小鼠） 原位SCLC小鼠模型（NCG小鼠）
重点核对
circRNA电穿孔条件：1400V、10ms、3脉冲，5µg/百万细胞 体内实验给药方案：皮下模型2×10^6 CAR-T细胞尾静脉注射，每4天一次，共5次；原位模型共8次 体外杀伤实验效靶比：0.25:1至10:1 对照设置：PBS或正常T细胞对照，以及mRNA-electroporated CAR-T对照 样本量与统计：每组至少3个重复，p<0.05为显著性阈值
摘要
目的：环状RNA（circRNA）因其相较于信使RNA（mRNA）具有更高的稳定性和更持久的蛋白表达，已成为一种有前景的RNA治疗分子。利用circRNA构建瞬时嵌合抗原受体（CAR）-T细胞，可以弥补传统病毒载体CAR-T方法的局限性，如流程复杂和长期副作用。方法：本研究首先重新确认了circRNA的优越特性，重点关注其稳定性和蛋白表达效率。随后优化了电穿孔条件，以将circRNA高效递送入人原代T细胞。接下来，构建了编码抗Delta样配体3（DLL3）CAR的circRNA，并通过电穿孔生成CAR-T细胞。在体外和体内模型（包括皮下和原位小细胞肺癌（SCLC）小鼠模型）中，将基于circRNA的CAR-T细胞与基于mRNA的CAR-T细胞的疗效进行了比较。结果：与基于mRNA的CAR-T细胞相比，基于circRNA的CAR-T细胞对SCLC表现出更优的疗效。体外实验显示肿瘤杀伤效果增强，而体内研究显示，在皮下和原位小鼠模型中，人SCLC肿瘤均被完全清除。这些结果强调了circRNA在CAR-T细胞治疗中的治疗优势。结论：本研究验证了circRNA-电穿孔策略在CAR-T细胞治疗中的可行性，并为治疗SCLC提供了一种潜在的有效方法，凸显了基于circRNA的技术在推进细胞治疗方面的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 利用circRNA-电穿孔策略构建靶向DLL3的CAR-T细胞，并评估其治疗小细胞肺癌的可行性及疗效是否优于mRNA-based CAR-T。
- 核心机制
- circRNA因其闭环结构抵抗RNase R降解，具有更高的稳定性和更持久的蛋白表达，从而延长CAR在T细胞表面的表达持续时间，增强CAR-T细胞的细胞毒性功能。
- 主要证据
- 体外共培养实验显示circRNA-based CAR-T在低效靶比下杀伤效率更高，且激活标志物CD69+和CD25+比例更高；体内皮下和原位SCLC小鼠模型中，circRNA-based CAR-T组肿瘤完全清除或显著抑制，生存期延长。
- 研究意义
- 研究验证了circRNA-电穿孔策略在CAR-T细胞治疗中的可行性，为SCLC提供了一种潜在有效的新治疗策略，并可能扩展到其他实体瘤。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circRNA与mRNA特性比较
比较circRNA与mRNA在蛋白表达持续时间、稳定性和免疫原性方面的差异。
将等摩尔量的circRNA和mRNA转染293T和H1299细胞，连续7天监测蛋白表达；室温孵育30天及不同FBS浓度下评估稳定性；转染A549细胞检测免疫原性相关细胞因子表达。
优化电穿孔条件
确定将circRNA高效递送入人原代T细胞的最佳电穿孔电压和circRNA剂量。
使用Neon™ NxT系统，测试不同电压（1400V、1600V、1800V）和circRNA浓度（1-6µg/百万细胞），通过流式细胞术评估EGFP和CAR表达阳性率、MFI及凋亡水平。
体外细胞毒性实验
评估circRNA-based anti-DLL3 CAR-T细胞对DLL3阳性SCLC细胞的杀伤效率并与mRNA-based CAR-T比较。
将CAR-T细胞与GFP标记的SHP-77和H69细胞以不同效靶比共培养24小时，通过荧光显微镜、流式细胞术评估杀伤效率，qPCR和ELISA检测细胞因子表达，流式分析T细胞激活和记忆亚群。
评估脱靶效应
验证anti-DLL3 CAR-T细胞对DLL3阴性正常肺上皮细胞是否有非特异性杀伤。
将CAR-T细胞与DLL3阴性正常肺细胞系BEAS-2B和16HBE以1:1效靶比共培养，RTCA监测细胞增殖，流式检测T细胞激活标志物，qPCR检测细胞因子表达。
皮下异种移植瘤模型疗效评估
在皮下SCLC小鼠模型中评估circRNA-based anti-DLL3 CAR-T细胞的抗肿瘤效果。
NCG小鼠皮下接种荧光素酶标记的SHP-77细胞，成瘤后尾静脉注射CAR-T细胞或对照，定期测量肿瘤体积、生物发光成像，记录生存期和体重，终点进行组织学检查。
原位肺癌模型疗效评估
在更接近临床的原位SCLC小鼠模型中验证circRNA-based CAR-T细胞的抗肿瘤效果。
NCG小鼠左肺实质注射荧光素酶标记的SHP-77细胞，建立原位肿瘤模型，尾静脉注射CAR-T细胞或对照，通过生物发光成像监测肿瘤进展，ELISA检测外周血细胞因子，终点进行组织学检查。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| PBMC分离 | Ficoll密度梯度离心 | Dakewe | 7922112 |
| T细胞分选 | EasySep™人CD3阳性分选试剂盒II | Stemcell | 17851 |
| T细胞激活 | ImmunoCult™人CD3/CD28 T细胞激活剂 | Stemcell | 10971 |
| T细胞培养 | X-VIVO 15培养基 | Lonza | 04-418Q |
| 白介素-2 | Stemcell | 78036.1 | |
| 质粒提取 | TIANprep中提质粒试剂盒 | Tiangen | DP106-02 |
| 质粒线性化 | NdeI限制性内切酶 | NEB | R0111S |
| PCR扩增 | 高保真Taq酶试剂盒 | TOYOBO | KOD-401 |
| circRNA合成 | HiScribe™ T7快速高产RNA合成试剂盒 | NEB | E2050S |
| 脱氧核糖核酸酶I | NEB | M0303S | |
| RNA纯化 | Monarch® RNA纯化试剂盒 | NEB | T2040L |
| circRNA验证 | 核糖核酸酶R | Novoprotein | E224 |
| mRNA合成 | N1-甲基假尿苷 | Jiangsu Synthgene Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| mRNA加帽 | mRNA加帽2′-O-甲基转移酶 | NEB | M0366S |
| 牛痘加帽酶 | NEB | M2080S | |
| mRNA加尾 | 大肠杆菌Poly(A)聚合酶 | NEB | M0276S |
| HPLC纯化 | 尺寸排阻色谱柱 | Sepax Technologies | 215980P-4630 |
| 电穿孔 | Neon™ NxT电穿孔系统 | ThermoFisher | Neon1 |
| 100 µL试剂盒 | ThermoFisher | N10096 | |
| 流式细胞术 | APC抗人CD3抗体 | Proteintech | APC-65133 |
| PE MonoRab™兔抗scFv混合液 | Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd. | A02285 | |
| 抗DLL3抗体 | Abcam | ab229902 | |
| PE驴抗兔IgG | Biolegend | 406421 | |
| 7-AAD活力染色液 | Biolegend | 420403 | |
| Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒 | Servicebio | G1511-50T | |
| FITC抗人CD69抗体 | Biolegend | 310903 | |
| PerCP抗人CD25抗体 | Biolegend | 356131 | |
| PE抗人CD45RO抗体 | Biolegend | 304205 | |
| PE/Cyanine7抗人CD45RA抗体 | Biolegend | 304125 | |
| APC抗人CCR7抗体 | Biolegend | 353213 | |
| ELISA | 人IL-2 ELISA试剂盒 | NeoBioscience | EHC003 |
| 人IFN-γ ELISA试剂盒 | NeoBioscience | EHC102g | |
| 人TNF-α ELISA试剂盒 | NeoBioscience | EHC103g | |
| 细胞增殖检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Biosharp | BS350A |
| 增殖检测 | 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 | -- | -- |
| 实时细胞分析 | xCELLigence RTCA TP | Agilent | -- |
| 免疫组织化学 | Triton X-100 | Solarbio | T8200 |
| 无动物源封闭液 | Cell signaling Technology | 15019 | |
| HRP标记二抗 | Beyotime | A0208 | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Solarbio | IT9100 |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 山羊抗兔IgG H&L (AF647) | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 抗淬灭封片剂 | Solarbio | S2100 | |
| 凝胶电泳 | GelRed核酸染料 | Aoqing | 218251122 |
| ssRNA分子量标准 | NEB | N0362S | |
| Western blot | Western及IP裂解液 | Beyotime | P0013 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Solarbio | P6730 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | LABLEAD | B5001 | |
| FuturePAGE™ 4-12% 12孔凝胶 | ACE Biotechnology | ET12412Gel | |
| Trans-Blot® Turbo™通用蛋白转印系统 | BIO-RAD | -- | |
| Tris缓冲盐溶液含Tween-20 | Solarbio | T1082 | |
| 化学发光HRP底物 | NCM Biotech | P10300 | |
| 抗DLL3抗体 | abcam | ab229902 | |
| 抗GFP抗体 | MBL | 598 | |
| 抗DAP12抗体 | Signalway Antibody | 49944 | |
| 抗肌动蛋白抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 抗微管蛋白抗体 | Proteintech | 66031-1-Ig | |
| 抗scFv抗体 | Genscript Biotech | A02282 | |
| RT-qPCR | FastPure细胞/组织总RNA提取试剂盒V2 | Vazyme | RC112-01 |
| PrimeScript™预混液 | TaKaRa | RR037A | |
| SYBR Green I染料 | Vazyme | Q111-02 | |
| AriaDx实时荧光定量PCR系统 | Agilent | -- | |
| 动物实验 | NCG小鼠 | GemPharmatech | T001475 |
| 生物发光成像 | AniView100 | Btlux | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| circRNA合成与纯化 | 体外转录温度与时间（37°C，2小时）；RNase R消化条件（37°C，30分钟）；HPLC纯化柱规格与流动相 阅读提示：Methods: circRNA synthesis; HPLC purification |
| CAR-T细胞生成 | 电穿孔电压（1400V）、脉冲宽度（10ms）和脉冲数（3）；circRNA剂量（5µg/百万细胞）；T细胞密度（3-4×10^6 cells/100 µL） 阅读提示：Methods: Generation of CAR-T cells; Figure 2 |
| 体外细胞毒性实验 | 效靶比范围（0.25:1至10:1）；共培养时间（24小时）；靶细胞类型（GFP-SHP-77和GFP-H69） 阅读提示：Methods: In vitro cytotoxicity assay; Figure 3 |
| 皮下异种移植瘤模型 | 小鼠品系（NCG）及周龄（6-8周）；肿瘤细胞接种量（2×10^6）；CAR-T细胞剂量（2×10^6）及给药次数（5次）；给药间隔（每4天） 阅读提示：Methods: Xenograft model and treatments; Figure 5 |
| 原位肺癌模型 | 肿瘤细胞接种量（1×10^6）；CAR-T细胞剂量（2×10^6）及给药次数（8次）；给药间隔（每4天）；监测周期（每周生物发光成像） 阅读提示：Methods: Xenograft model and treatments; Figure 6 |